鼠疫耶尔森氏菌与假结核耶尔森氏菌比较基因组学研究

摘要

鼠疫是由鼠疫菌引起的烈性传染病，同时鼠疫菌也是一种生物战剂。鼠疫的流行曾给人类带来巨大的灾难。目前，鼠疫虽得到有效控制，但世界卫生组织已将鼠疫列为重新抬头的传染病，并且鼠疫菌生物剂用于生物战和生物恐怖的可能性依然存在。因此，对鼠疫菌进行深入研究具有重要意义。 耶尔森氏菌属包括11个耶尔森氏菌种，其中鼠疫菌、假结核菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌对人致病，其它种对人不致病。鼠疫菌与假结核菌非常近缘，它可能是在1，500-20，000年前由假结核菌株O：1b进化而来。然而，鼠疫菌引起令人恐怖的鼠疫，而假结核菌仅引起肠道疾病。鼠疫菌比假结核菌多两个毒力质粒，这在一定程度上能解释它与假结核菌之间传播方式的不同。然而，两个毒力质粒的存在不足以解释鼠疫菌的特殊毒力。比较基因组学的方法有望阐明二者之间不同表型的分子机制。目前细菌比较基因组学的方法主要包括全基因组序列测定、全基因组芯片和抑制消减杂交等技术。利用全基因组序列进行比较基因组学研究无疑是最佳选择，但是，测定全基因组序列需要投入大量的人力和物力。细菌的不同生物型和不同分离株基因组之间存在着一定的差异。为比较它们之间的差异，不可能对每一株菌都进行全基因组序列测定，只能选择一些具有代表性的菌株进行测定，因此这个方法显然不现实。目前已有三株鼠疫菌和一株假结核菌的全基因组序列测定完成，这为我们比较二者之间的差别提供了丰富的信息。另一个比较理想的比较细菌基因组的方法就是全基因组芯片。全基因组芯片要求包括基因组内所有编码序列，这样的工作量和花费的才力也是相当巨大的。抑制消减杂交技术是近几年发展起来的一种比较基因组的方法。它通过对两组基因组DNA进行比较筛选出差异序列，有效抑制相同序列的检出，主要检出差异序列，而且花费的人力和物力相对较低。因此，本研究主要目的是通过抑制削减杂交技术，筛选出假结核菌相对于鼠疫菌的差异序列，制备差异片段DNA芯片，用制备的芯片筛选多株鼠疫菌和假结核菌，希望找到二者之间具有代表性的差异片段，为正确认识鼠疫菌的演化过程奠定基础。 通过抑制消减杂交技术和生物信息学比对，发现了108个假结核菌(Yps33)基因组中存在的特异DNA片段。将这些特异DNA片段与假结核菌(IP32953)全序列进行生物信息学比对，发现其中91个DNA片段在假结核菌IP32953株中存在，17个DNA片段是假结核菌Yps33特有的片段。用108个DNA片段制备芯片，通过芯片杂交进一步分析了这些差异DNA片段在6株假结核菌和27株鼠疫菌中的分布情况。结果发现了12个假结核菌中相对保守的DNA片段，它们在所有7株假结核菌中存在，而在27株鼠疫菌中不存在，这些片段代表15个基因。假结核菌与鼠疫菌的同源性极高，基于鼠疫菌的特异基因虽然可以鉴定鼠疫菌，但这些假结核菌特异基因的发现无疑为我们正确区分它们从而避免出现假阳性的结果提供了更可靠的保证。此外，这些特异片段也可作为假结核菌的特征标签用于鉴定假结核菌，从而避免鼠疫菌对它的干扰。这些基因在鼠疫菌中不存在，似乎是在鼠疫菌进化过程中，为了适应某些选择压力，逐渐失去了功能直至完全缺失掉。这个结论只是建立在一定数量菌株的基础之上，还有待于用大量的鼠疫菌和假结核菌株进行验证。 91个假结核菌Yps33株中存在的DNA片段分别与假结核菌IP32953株的相应基因对应，有的片段位于单一基因内，而有的片段跨越两个基因，共代表106个基因，提示在先有一株菌完成测序的情况下，通过抑制消减杂交比较细菌基因组之间的差异虽没有序列测定准确，但在很大的程度上能反映整个基因组的情况。 芯片杂交结果显示两株血清Ⅰ型假结核菌(Yps33和Yps28)存在所有108个DNA片段，其它4株假结核菌均有不同程度的片段缺失，血清Ⅰ型假结核菌与其它血清型相比存在9个特异DNA片段。这些特异DNA片段是否可用于正确区分血清Ⅰ型与其它血清型假结核菌还有待于更深入地研究。但至少可以说明，不同血清型假结核菌基因组之间存在一定的差别。 在鼠疫菌中，片段的存在与缺失基本上符合鼠疫菌在中国传播与进化的规律。以上结果随不能完全反映鼠疫菌的进化过程，但从这些结果我们似乎看到了鼠疫菌进化过程中的“遗迹”。

目录

摘要

引言

第一章材料与方法

一.实验材料

(一)接头和引物序列

(二)工具酶和DNA分子标准

(三)试剂盒

(四)主要试剂

(五)主要仪器

(六)常用试剂配制

(七)实验菌株

二.实验方法

(一)基因组DNA的提取

(二)消减杂交实验

(三)抑制消减杂交文库的构建

第二章实验结果

一.Rsa Ⅰ酶切结果分析

二.接头连接效率分析结果

三.消减杂交结果分析

四.序列测定和同源性比较分析结果

五.片段序列测定结果见附录

六.片段在GenBank中的登入号

七.特异片段功能注释

八.芯片杂交结果

第三章讨论

结论

附图

参考文献

附录1

附录2

综述一沙门氏菌毒力岛（SPIs）及其Ⅲ型分泌系统(TTSSs)

综述二高效液相色谱法(HPLC)在微生物分析鉴定中的应用

攻读博士学位期间发表文章

致谢