WNT信号通路在hMSCs相关的II型骨质疏松症发生中的作用

摘要

第一部分 入骨髓基质干细胞体外培养与诱导分化鉴定
　　 [目的]利用实验室已建立的hMSCs的培养方案,建立hMSCs的培养体系并做鉴定,为后续的实验研究提供细胞来源。
　　 [方法]骨髓样本取自美国波士顿市Brigham and Women's Hospital骨科因骨关节炎行全髋关节置换手术病人,从手术中分离的股骨头中分离获得。以密度梯度离心法获得单个核细胞,以贴壁分离方法获得hMSCs,在含有10％FBS的α-MEM的培养基中培养和传代扩增。在成骨、成脂肪、成软骨诱导下培养,分别用ALP活性检测、Alizarin Red S染色鉴定成骨细胞分化;利用Oil Red-O染色鉴定脂肪分化;利用Alcian blue染色鉴定软骨细胞分化。
　　 [结果]原代培养24h部分细胞开始贴壁伸展变形,48-72h后呈纺锤形或梭形,偶见形成集落,培养5-7d后见贴壁生长的细胞增殖迅速,可见多个细胞集落形成,当培养至第12-14d时,细胞已大部分融合,长满培养皿底,细胞成长梭形(成纤维样外观),有的细胞呈交叉重叠生长。一般5-10d可传一代,细胞可连续传4-10代。成骨细胞诱导分化后可检测到ALP活性,并见Alizarin Red S染色阳性细胞形成。成脂诱导分化后可见不同形状的Oil Red-O阳性染色细胞形成。成软骨细胞诱导分化可见Alcian blue阳性染色细胞形成。
　　 [结论]应用本实验方法从骨髓分离、培养和扩增获得 hMSCs,具有向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化的能力。
　　 第二部分 年龄和性别对人骨髓基质干细胞WNT基因表达的影响
　　 [目的]已有的研究对于hMSCs的WNT基因表达的描述不相一致,作者推测年龄和性别和其它临床因素的差异可以解释过去的研究显示的WNT基因在hMSCs中表达的不同。利用不同年龄和性别来源的hMSCs,检测WNT基因的表达,建立WNT基因在hMSCs的表达谱。
　　 [方法]骨髓样本取自美国波士顿市Brigham and Women's Hospital骨科行全髋关节置换手术的病人,从手术中分离的股骨头中分离获得。共19例样本来源的hMSCs被列入实验研究,来源包括12例女性和7例男性,年龄为36-85岁。其中9例为年轻样本(＜50岁,平均42.0±4.6岁),10例为老年样本(＞55岁,平均69.3±9.5岁)。12例样本来源女性为37-85岁,平均58.6±16.0岁,7例样本来源男性为36-82岁,平均52.6±16.0岁。将hMSCs在100mm组织培养皿中培养用传代至第2代(P2)和第4代(P4)的细胞进行实验。由于hMSCs来源于不同的个体,他们进行全髋关节置换的手术时间不同,为保证实验条件的一致性,所有的实验均采用标准的条件。hMSCs经体外培养、收集存储于Trizol试剂,冷冻于-80℃。所有19个样本收集齐全后同时进行RNA分离实验。最后采用RT-PCR检测所有WNT基因的表达。
　　 [结果]WNT2、3、4、5A、5B、6、7B、10B、11、13、14和16B共12个WNT基因被检测到在hMSCs中表达。相对于年老样本来源的hMSCs,年轻来源者表达WNT7B和WNT14显著升高。除此之外,WNT2和WNT13基因表达在年轻样本来源hMSCs组显示出表达显著升高的趋势。WNT基因表达和年龄相关性分析显示:WNT7B、WNT14和WNT13的表达强度与年龄呈显著反向相关。进一步分析显示,相对于女性来源的hMSCs样本,男性来源的hMSCs中WNT16B表达显著升高。WNT11在女性来源的hMSCs样本中表达呈现出显著性升高的趋势。在女性样本来源的hMSCs,WNT13基因表达与年龄呈现显著反向相关性。WNT4基因表达与年龄呈现显著正向相关性。在男性hMSCs,WNT7B基因表达与年龄呈现显著反向相关性,WNT14表达与年龄呈现反向相关性趋势。
　　 [结论]在hMSCs,大部分的老化相关的WNT基因属于经典WNT基因,WNT2、7B、13和14是年龄相关性WNT基因;除此之外,WNT4、7B、13、14和16的表达呈现性别特异性。
　　 第三部分 WNT信号通路对于hMSCs向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化的影响
　　 [目的]已有的采用小鼠脂肪前体细胞研究脂肪分化机制的结果表明,Wnt10b可以抑制脂肪分化并且促进成骨细胞分化,Wnt4和Wnt5可以促进脂肪细胞的分化,Wnt3a可以提高bmp2诱导的小鼠C3H10T1/2细胞向软骨细胞分化的能力。对于WNT信号通路在人脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化过程中的作用知之甚少。本实验设想WNT信号通路调节hMSCs向脂肪细胞分化、成骨细胞分化和软骨细胞分化,拟检测经典和非经典WNT信号通路在hMSCs向脂肪细胞分化中的作用,并且采用一个小分子的β-catenin激活剂(SB-216763)模拟经典WNT信号通路,阐述激活经典WNT信号通路对于hMSCs向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化的影响。
　　 [方法]骨髓样本取自美国波士顿市Brigham and Women's Hospital骨科因骨关节炎行全髋关节置换手术病人,经当地医学伦理委员会IRB允许,从手术中分离的股骨头中采用密度梯度离心分离获得。hMSCs在成脂、成骨、成软骨诱导培养基中培养,采用RT-PCR检测脂肪分化相关基因和WNT基因的表达,Western Immunoblotting检测β-catenin的表达,采用一个小分子的β-catenin激活剂SB-216763模拟经典WNT信号通路,检测激活经典WNT信号通路对于hMSCs向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化的影响。
　　 [结果]对脂肪细胞的标志基因的检测结果显示,在hMSCs成脂肪诱导1d后,检测到PPARγ2和LPL的基因表达,并随着继续培养而升高。Adipsin的表达随着成脂诱导培养时间的延长亦呈进行性升高。经典WNT家族成员,包括WNT2、10B、13、14表达逐渐降低,同时,非经典WNT家族成员,包括WNT4和11表达逐渐升高。然而,WNT5A的表达基本保持不变。WNT11是唯一的一个在脂肪分化标志基因出现表达升高之前表达改变的WNT基因。SB-216763(5μM)可以升高β-catenin在hMSCs中的表达水平,并且通过阻断PPARγ2、LPL和adipsin的基因表达抑制脂肪分化。与分子水平的作用一致,SB-216763模拟的经典WNT信号通路抑制脂肪细胞分化呈现时间和剂量依赖性。激活经典WNT信号通路可以抑制成骨细胞标志基因ALP的表达,抑制ALP的活性,促进软骨细胞标志基因RUNX2和COLⅡ的表达,促进Ⅱ型胶原的分泌。
　　 [结论]在hMSCs向脂肪细胞分化的过程中,非经典WNT信号通路的WNT4和11而非WNT5A可能是主要促进因子,而激活经典WNT信号通路可以阻止hMSCs向脂肪细胞、成骨细胞分化,促进其向软骨细胞分化。本实验研究说明在不同物种间,Wnt信号通路在向脂肪细胞和成骨细胞分化中所起的作用存在不同。
　　 第四部分 老化和性别对于hMSCs向脂肪细胞分化的影响
　　 [目的]本课题组前期的研究发现随着年龄的增加hMSCs发生一系列变化,向成骨细胞分化能力降低。本实验采用不同年龄和性别个体来源的hMSCs进行体外成脂诱导培养,观察其年龄和性别对hMSCs成脂肪细胞分化的影响,以期待揭示Ⅱ型骨质疏松患者骨髓腔脂肪容量增多的机制。
　　 [方法]15例hMSCs被列入实验研究,来源包括8例女性和7例男性,年龄为17-90岁,包括5例年轻样本和10例年老样本。在成脂诱导培养18d后检测不同年龄和性别组hMSCs形成脂肪细胞的差异。对于hMSCs脂肪细胞及成骨细胞相关基因表达相关实验研究,共有19例不同样本来源的hMSCs被纳入实验,包括12例女性和7例男性,年龄为36-85岁。其中9例为年轻样本,10例为老年样本,在基础培养条件下,检测脂肪细胞和成骨细胞标志基因在不同年龄和性别组之间表达的差异。
　　 [结果]年老来源的hMSCs在成脂诱导培养条件下,形成的脂肪细胞数目是年轻来源的hMSCs的2.35倍,但是统计学无显著性差异(P=0.30)。不同样本来源的hMSCs形成脂肪细胞数目和年龄的相关性分析显示,体外成脂诱导培养条件下,hMSCs分化成脂肪细胞的能力和年龄无显著相关性(Spearman,r=0.01899,P=0.95)。脂肪细胞的标志基因PPARγ2、LPL、Adipsin在年老来源的hMSCs中表达高于年轻来源的hMSCs,但是统计学均无显著性差异。成骨细胞标志基因RUNX2在年老来源的hMSCs中表达高于年轻来源者,而OC、ALP的表达在年老来源的hMSCs中高于年轻来源者,三者均无统计学差异。基因表达和年龄相关性分析显示,LPL基因表达随着年龄的升高显示出显著性升高的趋势。PPARγ2、Adipsin、Runx2、OC、ALP的表达与hMSCs来源个体的年龄均无显著相关性。在男性来源hMSCs,RUNX2的表达与年龄呈现反向相关性的显著趋势。
　　 [结论]体外诱导培养条件下,hMSCs脂肪细胞分化能力与年龄和性别无关,hMSCs向脂肪细胞分化能力与体内环境下表现不一致。