人新基因EOLA1的原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体制备

摘要

脓毒症(sepsis)是多器官功能障碍(MODS)的前兆，是当前危重病医学面临的难题之一，它也是导致严重烧伤、创伤患者死亡的主要原因之一；其发病机制与内毒素(LPS)激活血管内皮细胞诱发并加重全身炎症反应密切相关。脓毒症的病理生理机制复杂，现行的治疗措施有限，因此我们深入研究其发病机制就显得尤为重要。 近年来，由于血管内皮细胞是内毒素作用的直接靶细胞之一，国内外对LPS激活内皮细胞的作用途径、特异受体、胞内信号转导等方面研究较多。本研究室前期应用抑制消减杂交和cDNA末端扩增技术(RACE)，从LPS刺激后的人脐静脉内皮细胞中克隆到一个人类新基因全长cDNA序列，经Northernblot验证后作为人类新基因被GenBank全长序列库所接受(No.AY074889)。因其在受LPS刺激的内皮细胞中上调表达，故暂时命名为内皮高表达脂多糖相关因子1(endothelial-overexpressedlipopolysaccharide-associatedfactor1，EOLA1)。 目前，国外尚无关于该基因的相关研究，本实验室对EOLA1基因做了一些前期研究工作，并经生物信息学分析显示：该基因全长1404个bp，其定位于染色体Xq27.4，编码蛋白由158个氨基酸组成，分子量17.89kDa，等电点6.43，亲水性好，为可溶性蛋白。其二级结构含α螺旋、β片层结构和β转角，并形成一个螺旋—转角—螺旋(HTH)基序。EOLA1氨基酸序列包含N-糖基化位点、PKC磷酸化位点和酪氨酸激酶2磷酸化位点。 多组织Northernblot显示EOLA1基因除在LPS刺激的内皮细胞上调表达外，在骨胳肌、心脏、肾脏、肝脏和胎盘有较强的表达，在结肠、小肠、脾脏有较弱的表达，而在脑、胸腺、肺和外周白细胞则未见表达。在7种癌细胞株上，显示在早幼粒白血病系HL-60、海拉细胞系S3、慢性骨髓性白血病系K-562和肺癌细胞系A549都有表达，而在成淋巴细胞瘤性白血病MOLT-4和结直肠腺癌SW480表达水平最高，但在黑素瘤G-361无表达。在经过G418压力筛选后的稳定表达EGFP-EOLA1(enhancedgreenfluorescentprotein-EOLA1)融合蛋白的ECV304细胞株中发现EOLA1蛋白为全细胞分布。酵母双杂交显示EOLA1蛋白与细胞内金属硫蛋白相互作用，可能参与细胞生长和凋亡及抗炎症等多种生物学作用。目前该基因的功能未知，本课题拟制备抗EOLA1抗体，为研究其功能奠定基础。 本研究从该基因克隆开始，进行了原核表达重组质粒构建，在大肠杆菌中进行蛋白的诱导表达，经过蛋白纯化与复性后，免疫接种小鼠获得多克隆抗体并初步鉴定，为后期功能研究做基础工作。 本研究的主要结果和结论如下：从ECV304细胞中抽提到总RNA后，应用RT-PCR方法克隆到目的基因片段，琼脂糖凝胶电泳验证约500bp大小，应用PET-46EK/LIC空质粒和RT-PCR产物构建重组质粒；转化到非表达宿主菌(NovaBlueGigaSinglesTM)后，菌落PCR方法筛选鉴定，测序证明与EOLA1基因开放阅读框序列完全吻合，进一步验证EOLA1基因的真实性和准确性，PET-46EK/LIC-EOLA1重组质粒构建成功。 转化到大肠杆菌BL21(DE3)plysS中，成功诱导表达出EOLA1重组蛋白，主要以包涵体形式在胞质不溶性表达，分子量大小约20kDa左右；用带组氨酸(His)标签的鼠单抗作为一抗，进行WesternBlot能够验证特异表达的蛋白条带。经过蛋白表达条件的优化，确定最佳诱导条件为在宿主表达菌BL21(DE3)plysS中37℃诱导4h，Amp100μg/ml，IPTG浓度为1mmol/L。 EOLA1蛋白大量表达：诱导2000ml菌液，离心获得菌体湿重9.6g，经破菌、洗涤获得初步纯化的包涵体蛋白湿重0.76g，经亲和层析和透析复性后获得100ml目的蛋白溶液，BCA蛋白定量法测得其浓度为124.16ug/ml，SDS-PAGE及WesternBlot分析鉴定纯化结果。肽质量指纹图谱(PMF)分析显示：目的蛋白经酶解后能够测得分子量的5条短肽与EOLA1理论蛋白酶切肽段完全吻合，氨基酸序列吻合率为32％。免疫小鼠后获得的鼠源抗EOLA1多克隆抗体效价在1：10000以上，免疫印迹能够检测到天然EOLA1蛋白ECV304细胞株中的特异表达，验证了抗体特异性，为后期继续EOLA1基因功能研究奠定了基础。

目录

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英文缩写索引

前 言

第一部分人新基因EOLA1的原核表达与EOLA1蛋白纯化研究

材料和方法

结 果

讨论

第二部分人EOLA1多克隆抗体制备研究

材料和方法

结 果

讨论

全文结论

致 谢

参考文献

文献综述原核表达中包涵体形成与复性研究进展

攻读硕士学位期间发表的文章