致心律失常性右室心肌病病理学特征及其与桥粒蛋白的相关性研究

摘要

致心律失常型右室心肌病(arrhythmogenic right ventrieulareardiomyopathy，ARVC)为一种原发性心肌病，其特征性病理性改变为心肌细胞变性退变被纤维脂肪组织所替代，临床表现主要为室性心律失常，昏厥，猝死。1995年世界卫生组织(WTO)修订心肌病分类方法，首次正式将ARVC与扩张型心肌病、肥厚型心肌病、限制型心肌病和未分类心肌病一起并列为5种原发性心肌病。ARVC是一种家族性遗传病，主要为常染色体显性遗传，在人群中的发病率约为1/1000-1/5000，是目前公认的青年人尤其是年轻运动员猝死的一个重要原因。
　　 最初ARVC被认为是一种右心室疾病，随着对ARVC的解剖研究的不断深入，人们发现ARVC不只是局限于右心室，也可以累及左心室，然目前这些解剖学研究只是个例或少数案例报道，无法给出一个有实际参考价值的结论。
　　 自发现ARVC以来，国内外学者一直致力于ARVC发病机制的研究。近年来人们对ARVC的分子遗传学进行了大量研究，取得了显著进展，对ARVC的发病原因及发病机制也有了新的见解，目前普遍认为ARVC是一种桥粒蛋白编码基因突变导致的遗传性疾病。
　　 桥粒是细胞与细胞之间的连接结构，在心肌组织中主要位于润盘内。桥粒蛋白主要有三大类(1)跨膜蛋白包括desmocollins(DSC)和desmogleins(DSG)；(2)desmoplakin(DSP)负责连接细胞内的中间丝(或心肌细胞内的肌间丝)；(3)plakoglobin(JUP)及plakophilins(PKP)介导跨膜蛋白与DSP间的连接。2000年McKoy等在常染色体隐性遗传病Naxos综合征(ARVC隐性形式)病人中发现了第一个致病基因JUP基因。JUP基因编码桥粒蛋白plakoglobin，它是细胞间粘着连接的重要组成部分。这一发现揭示了ARVC可能是一种细胞间粘连紊乱引起的疾病。2002年Rampazzo等在常染色体显性遗传ARVC病人中发现了第一个缺陷基因DSP。2004年Gerull B等发现ARVC病人中有三分之一携带有PKP2突变基因。2006年相继发现DSG2，DSC2与ARVC相关。之后许多研究者针对这五个桥粒蛋白基因对ARVC病人进行基因检测，发现40％-50％的病人存在一个或多个基因突变，PKP2基因突变最常见(10％-45％)，DSP(10-15％)，DSG2(7-10％)，DSC2(2％)，其中DSP基因突变主要存在于病变累计左心室的ARVC病人中。
　　 虽然对ARVC病因及发病机制的研究取得了令人瞩目的进展，但仍有许多疑问有待解决：从现有数据看，明确诊断ARVC的病例中约有50％的病例存在桥粒蛋白基因突变，那么剩下的50％病例如何解释。近来发现了一些非桥粒蛋白基因突变也有可能导致ARVC，如cardiac ryanodine：receptor(RyR2)，transforminggrowth factor-β(TGF-β)，transmembrane protein-43(TMEM43)，但目前只有TMEM43与ARVC的关系比较明确，即使最终确定RyR2，TGF-β，TMEM43都能导致ARVC，所占比例也只是少数，远不能解释剩下的50％未有桥粒蛋白基因突变的病例。再者，心肌细胞间的电传导需要介导电偶联(缝隙连接)，而心肌细胞中缝隙连接基本上位于润盘内，紧挨着桥粒，有研究显示桥粒蛋白基因突变进而也可引起缝隙连接的改变，那么桥粒蛋白异常是否可能只是导致ARVC病人心律失常而并非心肌细胞被纤维脂肪组织取代的原因?编码桥粒蛋白基因突变是否也可以出现于其它有心律失常症状的心脏疾病中?本课题的目的为深入研究ARVC的病理学特征及其在左右心室的分布情况，重点阐明心肌桥粒蛋白与ARVC的相关性，探讨心肌编码桥粒蛋白基因突变是否为ARVC的特异性表现，其它心脏疾病是否也有编码桥粒蛋白基因突变，从而为ARVC的明确诊断提供参考价值。
　　 第一部分致心律失常性右室心肌病特征性病理病变在左右心室的分布情况
　　 致心律失常性右室心肌病(ARVC)是一种原发性心肌病，其病理学特征为右心室心肌被纤维脂肪组织所取代，是目前青年人及运动员猝死的一个主要原因。目前针对ARVC左右心室分布情况的解剖学研究比较少，尽管有许多案例报道发现ARVC不只是局限于右心室，也可涉及左心室，但都只是单个案例或少数几个案例，而针对ARVC左右心室分布情况的大样本的解剖学研究比较少。
　　 方法及结果:50例心脏样本均取自ARVC猝死病人，病理检查均有纤维脂肪组织取代心肌细胞，且未见其他异常病变。每个案例都先经肉眼大体观察病变的分布，再左右心室取材做成病理切片用显微镜检测。结果50例样本，其中仅有6例其纤维脂肪组织取代心肌细胞的病理变化只局限于右心室(12％，年龄25±5周岁)，25例样本左右心室均有该病理变化(50％，年龄36±3周岁)，剩下的19例样本其纤维脂肪组织取代心肌细胞的病理变化只局限于左心室(38％，年龄37±3周岁)。在左心室涉及病变的病例中，有54％的病例其病变有涉及左心室前壁，86％病例其病变有涉及左心室外侧壁，88％病例其病变有涉及左心室后壁，而43％的病例其病变有涉及室间隔。在左右心室均有ARVC特征性病理变化的案例中，有44％的案例发现心肌中有局部炎症；而病变局限于左心室的案例中，74％案例心肌中发现有炎症；病变局限于右心室的案例中，则发现有83％的案例心肌中有炎症。
　　 小结:在致心律失常性右室心肌病引起的猝死病例中，其特征性病理改变--纤维脂肪组织替代心肌细胞多数同时累及左右心室，且左心室最常累及的部位为左心室后外侧的心外膜下。与病变局限于左心室或左右心室均有病变的ARVC相比，病变局限于右心室的ARVC出现炎症的概率比较大。
　　 第二部分临床诊断为扩张型心肌病的移植心脏心肌组织中出现致心律失常性右室心肌病样变的研究
　　 纤维脂肪组织取代心肌细胞被认为是致心律失常性右室心肌病的特征性病理变化，而一些案例报道发现在扩张型心肌病中也有纤维脂肪组织取代心肌细胞病变。但目前针对扩张型心肌病的大样本量的组织形态学研究还比较少。
　　 方法:回顾性分析了5年周期里临床上诊断为非缺血性扩张型心肌病的移植心脏的大体观察，显微镜检测及其临床资料，从而分析相互间的关系。
　　 结果:64例临床上诊断为扩张型心肌病的病例，42例男性(平均年龄为51±13周岁)，22例女性(平均年龄为42±18周岁)。经病理诊断，55例(86％)为原发性扩张型心肌病。剩下9例(14％)，其中6例有与致心律失常性右室心肌病类似的纤维脂肪样变，2例呈现淀粉样变性，1例有结节病样改变，但临床上均无特异性表现。55例原发性扩张型心肌病心脏的平均重量为508g(220-980grams)，其中有4例并无心脏扩大或心腔扩张样变或明显的组织学改变(轻微型扩张型心肌病)；3例有陈旧性心肌炎样变；5例呈现中等左心室致密不全样变；5例病人先前有二尖瓣或三尖瓣的替代或修复治疗；7例产后性扩张型心肌病；家族性扩张型心肌病占了16％(9例)
　　 小结:当ARVC患者病变累及左心室时则易与扩张型心肌病混淆，导致误诊，因而临床上诊断原发性扩张型心肌病时需要特别注意排除ARVC的可能性。扩张型心肌病的病理表现比较多样化，其中左心室致密化不全并不少见。
　　 第三部分免疫组化技术定量检测致心律失常性右室心肌病心肌组织中桥粒蛋白的表达量的变化
　　 目前普遍认为致心律失常性心肌病(ARVC)是一种与桥粒蛋白编码基因突变相关的遗传性心肌疾病。有研究报道桥粒蛋白在ARVC心肌组织的表达存在显著变化，但至今为止仍缺乏大样本量研究的证实。
　　 方法:我们选取了23例源于ARVC猝死的心脏标本组织作为实验组，16例男性，7例女性，平均年龄均为33±15周岁，同时另外选取了21例心脏标本组织作为对照组(17例男性，4例女性，平均年龄分别为34±12周岁，32±12周岁)，其中15例死于非心源性原因，3例死于扩张型心肌病，剩下3例死于冠心病。在实验组，我们切取了50张组织切片，其中24张为左心室切片，26张为右心室切片。对照组，总共切取了28张组织切片，其中14张为左心室切片，另外14张为右心室切片。免疫组化染色心肌组织桥粒蛋白(plakoglobin，plakophilin，desmoplakin)，用计算机形态学测量软件分析相关蛋白表达面积。同时免疫组化染色心肌肌间丝蛋白(Desmin)作为组织固定与相关分析的内参对照
　　 结果:实验组与对照组中desmin的平均表达面积相似(85％Vs86％，p=0.75)。对照组中桥粒蛋白Plakoglobin的平均表达面积为4.7％±1.4％，而实验组中为4.5％±1.3％(p=0.5)。Plakophilin在对照组中的平均表达面积为4.5％±1.4％，实验组中平均表达面积为4.3％±1.3％(p=0.5)。对照组中：Desmoplakin的平均表达面积为3.2±1.0％，实验组中为3.2±0.9％(p=1.0).当单独比较实验组与对照组中左心室或右心室中桥粒蛋白的表达量，也没有发现有统计学差异(所有的p值>0.1)。
　　 结论:与对照组相比，实验组中桥粒蛋白的表达量虽有少量降低，但均无统计学差异变化，常规免疫组化染色心肌组织的桥粒蛋白并不能作为诊断ARVC的有效工具。
　　 第四部分 PKP2基因在致心律失常性右室心肌病病人及成年猝死综合征病人中突变情况的研究
　　 Plakophilin2(PKP2)为一种桥粒蛋白编码基因，是致心律失常性右室心肌病(ARVC)最常见的突变基因。PKP2基因突变可以导致间隙连接蛋白的异常，从而可能引起致命性心律失常，ARVC致死的原因即为心律失常。而致命性心律失常也可发生于解剖检查为阴性的猝死病人中(成年猝死综合征)，离子通道基因的突变被认为与该综合征的一些病例相关，目前为止还没有PKP2与成年猝死综合征相关性研究的报道。
　　 方法:50例心肌组织标本，其中25例为死于ARVC病人的心肌标本，其余25例为死于成年猝死综合征病人的心肌标本，直接从死后心肌组织中提取DNA，测序PKP2的所有14个外显子，检测基因突变。应用Primer Express3.0软件设计外显子引物，用BigDye Terminator DNA sequencing kit处理DNA样品后直接在3130 x1Genetic Analyzer测序PKP2各个外显子的正义链与反义链的序列。应用MutationTaster和Polyphen软件同时评估基因突变的致病性。
　　 结果:在25例ARVC心肌组织标本中，有6例发现有PKP2基因突变，总共有6个基因突变，其中4个基因突变经软件评估有致病性，且其中3个基因突变为新发现突变位点(p.N641del，p.L64PfsX22，p.G269R)。25例成年猝死综合征标本中，6例组织样本中总共发现6个PKP2基因突变，其中3个基因突变经软件评估为有致病性，其中4个基因突变为新发现突变位点(p.P665S，p.Y217TfsX45，p.E540，p.S615T)。致病性PKP2基因突变在ARVC中的发生率与在成年猝死综合征中发生率无统计学差异。
　　 小结：PKP2基因突变并非特异性针对致病性心律失常性右室心肌病，也可以出现在解剖检查呈阴性的猝死病例中。桥粒蛋白编码基因突变可能并非导致致心律失常性右室心肌病特征性病理变化的原因，而只是引起心律失常的一个原因。
　　 结论:
　　 1、在致心律失常性右室心肌病引起的猝死病例中，其特征性病理改变--纤维脂肪组织替代心肌细胞多数同时累及左右心室。
　　 2、左心室最常累及的部位为左心室后外侧的心脏外膜下。
　　 3、与病变局限于左心室或左右心室均有病变的ARVC相比，病变局限于右心室的ARVC出现局部炎症的概率比较大。
　　 4、当ARVC患者病变累及左心室时则易与扩张型心肌病混淆，导致误诊，因而临床上诊断原发性扩张型心肌病时需要特别注意排除ARVC的可能性。
　　 5、与正常心肌组织或其他心肌病组织相比，通过免疫组化技术检测的桥粒蛋白在致心律失常性右室心肌病心肌组织中的表达量并没有明显的统计学差异。
　　 6、常规免疫组化染色心肌组织的桥粒蛋白并不能作为诊断ARVC的有效工具。
　　 7、PKP2基因突变并非特异性针对致病性心律失常性右室心肌病，也可以出现在解剖检查呈阴性的猝死病例中。
　　 8、桥粒蛋白编码基因突变可能并不是导致的致心律失常性右室心肌病纤维脂肪组织样变的原因。为了明确桥粒蛋白与致心律失常性右室心肌病之间的关系，除了在致心律失常性右室心肌病中进行桥粒蛋白的基因型研究，还需在其他心脏疾病中进行更多的桥粒蛋白的基因型研究。
　　 创新点:
　　 1.致心律失常性右室心肌病是一种相对比较少见的遗传性心肌病，其典型病变为右心室心肌被纤维脂肪组织所替代。有些单个解剖案例或少数解剖案例报道发现纤维脂肪样变不只是出现于右心室，也可在左心室呈现，但目前为止还没有针对致心律失常性右室心肌病其特征性病变在左右心室分布情况的大样本量的解剖学研究。本课题选取了50例致心律失常性右室心肌病案例，得出的结果更具有参考价值。
　　 2.目前针对需移植手术治疗的原发性扩张型心肌病的形态学研究还比较少见，大样本量的研究更是少见。
　　 3.目前认为致心律失常性右室心肌病是一种与桥粒蛋白编码基因突变相关的遗传性心肌紊乱疾病，有研究发现在致心律失常性右室心肌病的心肌组织中桥粒蛋白的表达量有所改变，但目前还没有定量检测致心律失常性右室心肌病心肌组织中桥粒蛋白的表达量，且与对照组织进行比较分析统计学差异的研究。
　　 4.近年来的的研究显示桥粒蛋白编码基因突变在致心律失常性右室心肌病的发病过程中起了重要的作用，其中PKP2在致心律失常性右室心肌病中发生突变的概率最高。几乎所有检测PKP2突变的研究，DNA直接从血样中提取，很少有直接从心脏组织提取的。今年来许多离子通道疾病相关基因突变被认为与成人猝死综合征相关，但目前还没有PKP2基因突变与成年猝死综合征相关性的研究。