PLGA双层支架负载骨髓间充质干细胞修复兔膝关节骨软骨缺损

摘要

第一部分PLGA双层多孔支架的设计、制备及其生物相容性
　　目的:制备不同孔径孔隙率PLGA双层支架及其生物相容性研究。
　　方法:采用室温模压/粒子浸出法制备上下层不同孔径孔隙率双层支架。将聚乙交酯-丙交酯(PLGA)溶于二氯甲烷后与不同粒子大小的氯化钠晶体致孔剂（氯化钠粒子大小范围有50-450μm）或不同质量比的氯化钠致孔剂混合，然后填入预制的模具中模压成型24h，脱模以后，得到柱状的混合物。不同粒子大小致孔剂或不同含量致孔剂的柱状混合物通过二氯甲烷粘合起来，然后裁剪成特定的尺寸。将致孔剂用去离子水浸出以后，即得到所需的双层支架。同时将分离培养获得的兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)接种于PLGA双层支架，体外培养1周后扫描电子显微镜观察。
　　结果:成功获得直径4 mm、高度5 mm的PLGA双层多孔支架，其中不同孔径的5种，不同孔隙率的3种。所有支架上层高度1mm、下层高度4mm。电镜观察示支架孔的形态良好，孔与孔之间相通，上下层整合一体且相互连通。BMSCs接种于支架体外培养后，细胞在所有支架的孔壁上黏附良好，可见细胞外基质沉积。
　　结论:室温模压/粒子浸出法可制备不同孔径孔隙率的PLGA双层支架，且PLGA双层支架生物相容性良好。
　　第二部分PLGA双层支架不同孔径对兔膝关节骨软骨缺损修复效果的影响
　　目的:探讨一体化PLGA双层支架负载骨髓间充质干细胞修复兔膝关节骨软骨缺损的可行性，了解不同孔径双层支架对骨软骨缺损修复效果的影响。
　　方法:采用室温模压/粒子浸出法以PLGA为原料制备5组不同孔径的一体化双层多孔支架，致孔剂粒子大小范围为50-450μm。来自新西兰大白兔的骨髓间充质干细胞(BMSCs)用荧光染料DiI标记后，以1×106/20μl接种于双层PLGA支架的软骨层，体外共培养1周，制成双层PLGA支架-细胞复合物，并在电镜下观察。接种细胞或相应未接种细胞的双层支架植入兔膝关节骨软骨缺损模型（直径4 mm，深度5 mm）。于术后6周和12周取材行大体观察、组织学评分及免疫组织化学染色观察。术后6周标本一分为二切开，部分标本做冰冻切片，DAPI复染，荧光显微镜下示踪BMSCs。另外，12周标本一分为二切开，取一半行real time-PCR检测基Ⅱ胶原(Collagen typeⅡ，ColⅡ)、蛋白聚糖(Aggrecan，AGC)及Ⅰ型胶原(Collagen typeⅠ，ColⅠ)三种基因相对表达水平。
　　结果:成功获得5种不同孔径PLGA双层支架（孔径大小范围为50-450μm）。电镜观察示BMSCs在支架内生长良好。术后6周，荧光显微镜下观察见DiI标记的细胞存活于缺损区。12周大体观察显示支架B（软骨层孔径100-200μm、骨层孔径300-450μm）负载细胞修复的组织表面光整，新生组织和周边界限不清，质地接近正常组织;其他支架植入物都有不同程度的修复，但差于接种细胞的支架B。组织学评分显示负载细胞的支架B组评分最低，和其他支架组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。术后12周免疫组织化学染色示负载细胞的支架B标本软骨区ColⅡ及软骨下骨区ColⅠ表达均强阳性。另外，12周后负载细胞的支架B组ColⅡ基因表达水平最高，和其他植入物比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。尽管负载细胞的支架B组AGC的表达水平最高，但各组间无明显统计学差异(P＞0.05)。ColⅠ表达水平支架B和支架D（软骨层孔径300-450μm、骨层孔径100-200μm）间有明显差异(P＜0.05)，其他组之间比较无明显统计学差异(P＞0.05)。
　　结论:一体化PLGA双层支架负载BMSCs支持软骨及软骨下骨的同时再生，其中软骨层孔径100-200μm、骨层孔径300-450μm的PLGA双层支架修复效果最好。双层多孔支架的不同孔径对骨软骨缺损修复效果有影响。
　　第三部分PLGA双层支架不同孔隙率对兔膝关节骨软骨缺损修复效果的影响
　　目的:探讨不同孔隙率PLGA双层支架负载BMSCs修复兔膝关节骨软骨缺损的可行性，分析不同孔隙率双层支架对骨软骨缺损修复的影响。
　　方法:筛选粒子大小为200-300μm的氯化钠晶体致孔剂，和PLGA按不同质量比混合，采用室温模压/粒子浸出法制备3组不同孔隙率的一体化双层多孔PLGA支架。然后对不同孔隙率3种支架行机械力学性能检测。用DiI标记BMSCs，以1×106/20μl接种于双层PLGA支架的软骨层，体外共培养1周，制成双层PLGA支架-细胞复合物，并在电镜下观察。将接种细胞或相应未接种细胞的双层支架植入兔膝关节骨软骨缺损模型（直径4 mm，深度5 mm）。于术后6周和12周取材行大体观察、组织学评分及免疫组织化学染色观察。术后6周标本一分为二切开，部分标本做冰冻切片，DAPI复染，荧光显微镜下示踪BMSCs。另外，12周标本同样一分为二切开，取一半行real time-PCR检测相关基因表达水平。
　　结果:成功获得3种不同孔隙率PLGA双层支架，孔隙率范围为77％-92％，孔径大小范围均为200-300μm。力学性能结果显示支架A（软骨层孔隙率92％、骨层孔隙率77％）应力应变曲线有两个斜率，而支架B（软骨层、骨层孔隙率均为85％）和C（软骨层孔隙率77％、骨层孔隙率92％）只有一个斜率。支架A软骨层的压缩模量E1:3.8±1.1 MPa，骨层压缩模量E2:29.1±5.0 MPa。支架B压缩模量为16.1±3.2 MPa，支架C骨层压缩模量为0.7±0.2 MPa，软骨层未检测出。电镜检测显示BMSCs在支架内生长良好。术后6周，荧光显微镜下观察见DiI标记的细胞存活于缺损区。12周大体观察显示支架A负载细胞修复的组织表面光整，新生组织和周边界限模糊，质地接近正常组织;其他支架植入物都有不同程度的修复，但差于接种绌胞的支架A。组织学评分（最高总分值减去所评分值）显示接种细胞的支架A组评分最高，和支架C组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。术后12周免疫组织化学染色示接种细胞的支架A组软骨区ColⅡ及软骨下骨区ColⅠ表达均强阳性。另外，12周后新生组织基因表达水平显示接种细胞的支架A组ColⅡ基因表达水平最高，和支架C组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。尽管接种细胞的支架A组ColⅠ和蛋白聚糖表达水平较其他组更高，但各组间无明显统计学差异（P＞0.05）。
　　结论:不同孔隙率PLGA双层支架负载BMSCs支持软骨及软骨下骨的同时再生，其中软骨层孔隙率为92％、骨层孔隙率77％的PLGA双层支架修复效果最好。双层多孔支架的不同孔隙率对骨软骨缺损修复效果有影响。

目录

论文说明

英文缩略语注释

摘要

前言

参考文献

第一部分 PLGA双层支架的设计、制备及生物相容性

引言

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、结论

参考文献

附图

第二部分 PLGA双层支架不同孔径对兔膝关节骨软骨缺损修复效果的影响

引言

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、结论

参考文献

附图

第三部分 PLGA双层支架不同孔隙率对兔膝关节骨软骨缺损修复效果的影响

引言

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、结论

参考文献

附图

不足之处与进一步研究方向

全文总结

综述

附录一：学习期间所取得的科研成果和奖励

附录二：学习期间已发表的主要论文

致谢

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