结核分枝杆菌的耐药性及结核病的宿主易感性研究

摘要

结核分枝杆菌(M.tuberculosis)是一种细长略带弯曲的杆菌，生长缓慢，1882年德国细菌学家郭霍(Koch)证实结核分枝杆菌是结核病的病原菌，该菌能侵犯全身各器官，以肺为最常见。据WHO估计，全球每年约有800～1000万新发结核病例，至少有200-300万人死于结核病，由于艾滋病、吸毒、酗酒、贫困、免疫抑制剂的使用、人口流动、结核分枝杆菌耐药株出现等原因，20世纪末21世纪初，结核的发病率又有上升趋势，并随着有限的抗结核药物使用年数的增长，结核菌的耐药情况日渐严重，耐多药结核病(MDR-TB)和广泛耐药结核病(XDR-TB)的出现更为结核病的控制带来新的挑战。我国的结核病疫情始终较为严重，是世界上22个结核病高负担国家之一，也是27个耐多药/广泛耐药结核病(MDR/XDR-TB)高负担国家之一。
　　结核发病是多种因素共同作用的结果，目前全球虽有近1/3的人群感染结核分枝杆菌，但仅1/10人口发病。以往研究认为结核的发病原因主要在于细菌因素、环境因素和社会因素，但越来越多研究表明宿主也是重要因素，目前认为结核的发病是宿主、病原体、环境综合作用的结果。已有较多研究表明，结核易感性的遗传因素在疾病中起重要作用，导致不同个体对结核易感性的差异，Khor等人发现细胞因子可诱导的SRC同源2结构域蛋白(Cytokine-inducible SRChomology2(SH2) domain protein，CISH)基因的单核苷酸多态性与结核等多种感染性疾病的易感性有关，在不同疾病及不同人群中基因的多态性位点及多态性频率都不同。CISH是细胞因子信号抑制因子(SOCS)家族蛋白的一员，调节多种细胞因子信号传导途径，通过与STAT5竞争细胞因子受体上的结合位点主要影响IL-2的信号转导。鉴于IL-2在结核免疫中的关键作用，推测CISH有可能在结核病发病中起了重要作用
　　本研究收集上海市肺科医院1432株结核分枝杆菌进行体外药敏测定，对上海地区的结核病耐药情况进行了分析。并采用病例-对照研究，收集511例初治肺结核患者及500例健康对照者的资料，分析人群的营养状况指标和社会环境影响因素与肺结核发病之间的关系。通过对898例结核病患者血液样本采用SNaPshot技术进行CISH基因单核苷酸多态性(SNPs)分型，与825例健康者对照，了解上海地区汉族人群CISH基因多态性与结核易感性的关系，研究CISH基因多态性在结核发病中的作用。
　　第一部分上海地区结核分枝杆菌的耐药现状研究
　　我国作为结核病高负担国家之一，耐多药/广泛耐药结核病亦在不断增多。我们对收集自上海市肺科医院的结核分枝杆菌菌株进行了耐药性分析，并比较初治与复治患者结核分枝杆菌对抗结核药物的耐药率。上海市肺科医院为上海市结核病定点医院，收治几乎所有的上海市结核病患者。
　　2009年1月至2010年12月收集了上海市肺科医院住院结核病患者中分离培养的结核分枝杆菌菌株1432株，每例患者保留1株菌种。1432个患者的中位年龄为47(12～94)岁，其中男性1001例，女性431例;初治者837例，复治者595例。结核分枝杆菌的分离培养及药敏测定方法:①取患者痰液或其他体液、组织标本，经前处理后放入BACTEC MGIT960全自动分枝杆菌培养仪培养，②培养结果阳性后进行涂片、染色、镜检确定抗酸分枝杆菌并接种至含PNB培养基及TCH培养基的培养管行菌种鉴定，③BACTEC MGIT960全自动分枝杆菌培养仪对结核分枝杆菌进行链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、阿米卡星、卷曲霉素、氧氟沙星的药敏试验。
　　药敏结果显示:①1432株结核分枝杆菌对抗结核药物的耐药率（对一个或一个以上抗结核药物耐药）为63.5％，对异烟肼的耐药率最高，为46.4％，对链霉素、利福平和氧氟沙星的耐药率均超过30％，对阿米卡星的耐药率最低，为16.1％。②复治患者分离的结核分枝杆菌对抗结核药物的耐药率明显高于初治患者分离的菌株，初治患者菌株对7种抗菌药的耐药率均低于30％，复治者对阿米卡星和卷曲霉素的耐药率分别为24.2％和29.2％，对其他抗结核药的耐药率均近50％或以上。③所有菌株对一线抗结核药物的耐药率为53.1％，初治者耐药率为33.8％，复治者为80.2％;④所有菌株对二线抗结核药物的耐药率为45.8％，初治者耐药率为33.1％，复治者为63.7％，在二线结核药物中氧氟沙星的耐药率最高，为36.2％，阿米卡星的耐药率最低，为16.1％。⑤所有菌株中MDR菌株占32.2％，XDR菌株占11.3％;在初治患者中MDR菌株占10.5％，复治患者占62.7％，两者有显著差异（P＜0.01）;在初治和复治患者中XDR株的检出率分别为3.8％和21.8％，两者有显著差异（P＜0.01）。⑥在所有MDR菌株中，XDR菌株占35.1％，初治者MDR菌株中XDR株占36.4％，复治者MDR菌株中XDR株占34.9％，初复治患者XDR/MDR比例无显著差异（P=0.79）。⑦在所有MDR菌株中，pre-XDR菌株占42.3％，这些菌株90.3％对氧氟沙星耐药。
　　结论:上海地区结核分枝杆菌对抗结核药物的耐药性较高，除对阿米卡星的耐药率在20％以下外，对多数抗结核药的耐药率超过30％。53.1％的结核分枝杆菌对一线抗结核药物耐药，其中对异烟肼的耐药率最高。45.8％的结核分枝杆菌对二线抗结核药物耐药，其中对氧氟沙星的耐药率最高。所有菌株中，MDR菌株占32.2％，XDR菌株占11.3％。
　　第二部分初治肺结核患者易感因素分析
　　影响结核病发病的因素很多，包括贫穷、精神压力、营养不良、病毒感染，以及自身免疫力的变化等，各因素之间交互作用，该部分研究分析人群的营养状况指标和社会环境影响因素与肺结核发病之间的关系，为采取针对性的措施控制肺结核疫情提供依据。
　　我们收集2009.1～2011.1上海市肺科医院的511例确诊初治肺结核住院患者的病史资料，其中男性329例，女性182例，中位年龄34(12～79)岁，并收集同期入选的500例健康体检者资料作对照。收集研究对象的信息包括:①社会环境影响因素资料:年龄、性别、婚姻、职业、教育背景、结核接触史、粉尘接触史、吸烟史、饮酒史等，②营养状况指标:身高、体重、血总蛋白、白蛋白、甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等。对数据进行X2检验、单因素分析、多因素Logistic回归分析，确定初治肺结核患者的易感因素。
　　结果显示，社会环境因素中，婚姻状况(P=0.001)、职业(P＜0.001)、文化程度(P＜0.001)、吸烟史(P＜0.001)在病例组与对照组之间差异有统计学意义。营养状况指标中，体重指数(BMI)(P＜0.001)、血清总蛋白(P＜0.001)、白蛋白(P＜0.001)、总胆固醇(P＜0.001)、甘油三酯(P＜0.001)、高密度脂蛋白、(P＜0.001)在病例组与对照组之间差异有统计学意义。另外，多因素Logistic回归分析显示:BMI(P＜0.001)、吸烟史(P＜0.001)、甘油三酯(P＜0.001)、高密度脂蛋白(P＜0.001)、低密度脂蛋白(P=0.003)与肺结核发病有显著性相关性。
　　结论:本研究结果显示，文化程度低、离异或丧偶、吸烟是肺结核发病的危险因素。BMI过低、营养不良是结核发病的危险因素，与国外报道相仿。此外，本研究发现，高含量的低密度脂蛋白是肺结核发病的危险因素，但血清高含量的甘油三酯和高密度脂蛋白似乎与肺结核发病负相关，尚需进一步研究证实。
　　第三部分 CISH基因的单核苷酸多态性与结核易感性的关系
　　已有较多研究表明，多种宿主基因多态性与结核易感性相关。2010年，Khor等发现CISH基因多态性与结核等多种感染性疾病易感性相关，且不同人群间多态性不同，与结核易感性的关系也不同，近2年尚未见后续有关该基因与结核易感性相关的研究报道。本研究目的为了解中国汉族人群CISH基因SNP与结核易感性的关系。
　　我们选取上海市肺科医院自2009.1-2011.1收治的898例确诊结核病的患者，采用多重SNaPshot SNP分型技术检测其血液标本CISH基因5个SNP位点(rs148685070(-639), rs414171(-292), rs6768300(-163), rs2239751(+1320),rs622502(+3415))的多态性，并与825例健康者对照。采用在线的SHEsis软件结合SPSS15.0统计软件对病例组和对照组SNPs检测结果进行统计分析，包括对照组基因型Hardy-Weinberg遗传平衡检验;等位基因频率及基因型频率在两组间的比较;CISH基因SNPs与结核相关性的单因素及多因素logistic回归分析;不同位点间连锁不平衡分析;并在不同SNPs间构建单倍型，估算其频率，分析单倍型与结核易感性的相关性。
　　结果显示:①所测CISH基因5个SNPs位点中rs148685070只有一种等位基因C及一种基因型CC，无基因多态性，余4个位点均有基因多态性。②位点rs414171在结核病组中等位基因A的频率(61.6％)高于对照组(57.6％)，差异有统计学意义(P=0.016)，基因型A/A的频率(38.8％)高于对照组(31.9％)，差异有统计学意义(P=0.011);位点rs2239751在结核病组中等位基因A的频率(67.9％)高于对照组(64.5％)，差异有统计学意义(P=0.036)，但基因型频率在两组中无显著差异。③SNPs与结核易感性单因素分析结果显示年龄、rs414171TA基因型、rs2239751CC基因型与结核易感性相关（P值分别为0.017，0.003，0.026，OR值分别为1.007，0.731，0.712）。④SNPs与结核易感性多因素logistic回归分析结果显示，年龄始终是结核发病的独立危险因素，随着年龄的增加，结核病发病的风险增加(P=0.017，OR=1.008)。在4个多态性位点中，rs2239751CC基因型及rs414171TA基因型是独立危险因素(P值分别为0.011，0.002，OR值分别为0.671，0.710)。⑤连锁不平衡分析结果显示rs414171与rs2239751两个位点间、rs6768300和rs622502两个位点间存在连锁不平衡。⑥单倍型分析显示，共有3种单倍型频率＞5％，在病例组和对照组中无显著差异。
　　结论:本研究显示CISH基因的SNPs与结核易感性相关，在4个多态性位点中rs2239751CC基因型及rs414171TA基因型是独立危险因素。这是首次在中国大陆汉族人群中进行CISH基因单核苷酸多态性的检测分型并分析其与结核病易感性的关系。

目录

摘要

英文缩写

第一部分 上海地区结核分枝杆菌的耐药现状研究

前言

材料与方法

结果

小结

讨论

参考文献

第二部分 初治肺结核易感因素分析

前言

材料与方法

结果

小结

讨论

参考文献

第三部分 CISH基因的单核苷酸多态性与结核易感性的关系

前言

材料和方法

结果

小结

讨论

参考文献

研究主要创新点

不足之处及改进方法

综述 结核分枝杆菌对喹诺酮类抗菌药的耐药性及耐药机制研究进展

在读期间发表的文章

在读期间参加主要学术活动

致谢

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