小型猪自体移植肾灌注短效Caspase-3小干扰RNA冷保存导致肾损伤加剧的机制初探

摘要

目的:在小型猪自体肾移植模型中探究短效Caspase-3小干扰RNA(smallinterfering ribonucleic acid，siRNA)在体内外研究中实验结果相悖的机制，迸一步探讨短效Caspase-3 siRNA对凋亡通路蛋白caspase-3活化的影响，阐明短效Caspase-3 siRNA的激活固有免疫反应机制，为其临床转化提供理论依据与实验基础。
　　方法:选择25-30kg雄性广西巴马小型猪12只，随机分为I/R组6只(I/R)，Caspase-3 siRNA组6只（IR+siRNA）。建立小型猪原位自体肾移植模型，根据前期研究，左肾切取后siRNA组应用预配40ml UW器官保存液+0.3mg短效Caspase-3 siRNA（合成序列5'-GGGAGACCUUCACAAACUUtt-3'与5'-AAGUUUGUGAAGGUCUCCCtg-3'）加压灌注，I/R组应用UW器官保存液同样加压灌注，冷藏24小时，移植前留取冷藏后肾脏穿刺标本，再移植到右肾原位。各组于缺血再灌注后48h切取肾脏组织标本。应用real time PCR检测各组肾脏组织中Caspase-3 mRNA及Toll样受体信号通路下游相关炎性因子的mRNA相对载量，应用western blot检测各实验组小型猪肾组织中前体Caspase-3、活化型Caspase-3的表达水平。应用western blot方法检测各组肾组织中TLR-3、TLR-7、 TRIF、MyD88、PKR、RIG-1、HMGB1蛋白的表达水平。
　　结果:自体肾移植48小时后，IR+siRNA组肾脏组织内TLR-3、TLR-7、MyD88、TRIF、PKR蛋白含量均较IR组有显著上升，半定量结果具有统计学差异;IR+siRNA组肾脏组织中，Toll样受体信号通路下游相关炎性细胞因子mRNA水平较IR组有明显升高，结果具有统计学差异;免疫印迹法检测Caspase-3蛋白载量，半定量结果显示:移植前穿刺标本，siRNA组较I/R组Caspase-3蛋白载量明显减少（吸光度OD值1.02±0.24 vs.2.32±0.28，p＜0.01），但移植后48h肾脏标本，siRNA组较I/R组Caspase-3的17kD活性裂解片段明显增多（OD值:0.22±0.04 vs.0.06±0.01，p＜0.05）。移植后48小时，IR+siRNA组肾脏组织标本中HMGB1的蛋白载量显著高于IR组，半定量结果具有统计学差异。
　　结论:本研究中应用的人工合成的siRNA能有效沉默局部Caspase-3 mRNA转录Caspase-3蛋白，在冷保存过程中有效减少细胞凋亡，但移植后肾脏的损伤反而有所增加，凋亡细胞增多，活性Caspase-3裂解片段水平上升;造成这一结果的主要原因是由Toll样受体系统识别外源性siRNA，触发启动了机体的系统性炎症反应，增强了局部组织的炎性损伤与细胞凋亡;这一损伤作用能够持续至48小时，可能的机制为负反馈循环作用以及HMGB1蛋白参与了后续的循环级联放大炎症反应及细胞凋亡过程;siRNA疗法作为新型干预手段，在临床应用前仍需进一步消除其系统性副作用。

目录

摘要

引言

材料与方法

一、材料

二、实验方法

实验结果

一、Toll样受体活化结果测定

二、Toll样受体下游信号通路活化检测

三、非Toll样受体依赖的siRNA识别途径检测

四、肾组织中Caspase-3表达

五、肾组织中相关炎性因子mRNA载量

六、肾组织中HMGB1蛋白含量检测

讨论

全文小结

参考文献

致谢

附录一：研究生在读期间论文目录

附录二：综述

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