利用RNA干扰技术建立稳定抑制猪内源性逆转录病毒表达的西藏小型猪成纤维细胞

摘要

目的：建立稳定抑制猪内源性逆转录病毒(porcine endogenousretrovirus,PERV)表达且不含PERV-C的猪成纤维细胞,为下一步培育更安全的转基因猪提供核供体细胞,从而解除异种器官和细胞在异种移植和生物人工肝应用中的PERV感染的风险。rn 方法：选择具有PERV低拷贝数且不含PERV-C的西藏小型猪,获取其成纤维细胞; 再利用RNA干扰技术,针对PERV高度保守的gag和pol区域,设计6对shRNA(gag1,gag2,gag3,poll,pol2,pol3)和2对阴性对照(negmive control,NC)(gag-NC,pol-NC),进行化学合成,通过转染稳定表达PERV的HEK293细胞,利用Real time RT-PCR、Western blot analysis和细胞免疫化学评价PERV在mRNA和蛋白水平的表达情况,筛选出能够抑制PERV表达最为有效的short hairpin RNA(shRNA)片段,并利用逆转录病毒表达载体pSuper-retro-GFP/neo作为shRNA的表达载体系统。将该片段导入西藏小型猪成纤维细胞,抑制该细胞中PERV表达,建立稳定表达shRNA的猪成纤维细胞,并再次验证PERV在该细胞中mRNA和蛋白水平的表达情况。rn 结果： 我们发现shRNA-pol3是抑制PERV表达最为有效的片段; 获得稳定表达shRNA-pol3的西藏小型猪成纤维细胞与猪胚肾细胞株PK15和野生型的西藏小型猪成纤维细胞相比,PERV mRNA表达量仅约10％,PERV P15E蛋白表达也显著下降。rn 结论：本研究获得的稳定表达shRNA的西藏小型猪成纤维细胞具有较前更低的PERV拷贝数,且没有PERV-A/C感染的风险,可以作为下一步培育更为安全的稳定表达shRNA的转基因猪的核供体细胞。