新型断裂蛋白质内含子介导的蛋白质反式剪接系统的建立及应用

摘要

蛋白质内含子(intein)是前体蛋白质中的一段插入序列，被认为是基因内含子(intron)在蛋白质水平上的等效物质，它通过催化蛋白质剪接反应将自身从前体蛋白质中剪切出来，并将两侧的蛋白质外显子序列（N-端蛋白质外显子和C-端蛋白质外显子）以天然肽键连接。断裂型蛋白质内含子(split-intein)是蛋白质内含子的断裂形式，表达前体蛋白质的开放阅读框被分裂成了两个基因，断裂位点是在蛋白质内含子的序列内，断裂蛋白质内含子因此得名。N-端蛋白质外显子(EN)与断裂型蛋白质内含子的N端(IN)形成的融合蛋白，称为N-端前体蛋白质。断裂型蛋白质内含子的C端(IC)与C-端蛋白质外显子(EC)形成的融合蛋白，称为C-端前体蛋白质。分离的IN与IC能够通过结构互补相识别以非共价键结合，形成有功能的蛋白质内含子，从而催化蛋白质反式剪接反应，将两个分离的蛋白质外显子(EN、EC)以肽键连接。蛋白质反式剪接正逐渐成为蛋白质工程中的重要工具，已经在多肽连接、基因治疗等方面得到应用。
　　传统的S0型断裂蛋白质内含子是在靠近蛋白质内含子中部的位置断裂，含有较大的N-端和C-端，难于化学合成。近来，人们构建了新型的S1型断裂蛋白质内含子，断裂位点是在靠近蛋白质内含子N-末端的位置，其N-端较小，仅有11个氨基酸残基。如果N-端蛋白质外显子也是较小的多肽，人们可以比较容易地化学合成由N-端蛋白质外显子与S1型断裂蛋白质内含子N-端形成的N-端蛋白质前体，而N-端蛋白质外显子可在人工合成过程中添加某种修饰基团或探针标记，在蛋白质反式剪接后，N-端蛋白质外显子被连接到目标蛋白质的剩余部分即C-端蛋白质外显子上，因此修饰基团或探针标记被随之添加到了整个目标蛋白质分子上。Ssp DnaB S1型断裂蛋白质内含子已经被成功应用于体外重组蛋白质的N-末端荧光标记和动物细胞表面蛋白质的标记。此外，人们构建了新型的S11型断裂蛋白质内含子，断裂位点是在靠近蛋白质内含子C-末端的位置，其C-端较小，仅有6个氨基酸残基。同理，如果C-端蛋白质外显子是较小的多肽，可通过S11型断裂蛋白质内含子的反式剪接将修饰或标记过的C-端蛋白质外显子连接到目标蛋白质的C-末端。Ssp GyrB S11型断裂蛋白质内含子已经被用于在重组蛋白质的C-末端添加荧光基团。S1型断裂蛋白质内含子、S11型断裂蛋白质内含子介导的蛋白质反式剪接又被称为多肽-蛋白质剪接、蛋白质-多肽剪接。为蛋白质添加荧光基团或同位素等探针标记在细胞定位研究、蛋白质示踪方面具有很重要的作用，而化学修饰（例如非天然的氨基酸）可以有助于研究蛋白质结构-功能之间的关系。常规的添加探针标记的化学方法通常以特定的氨基酸侧链（硫醇基、羧基、氨基等）为靶标，蛋白质中的不同位置可能存在多个靶标，因此会产生多种混合的修饰性蛋白质。用于特异性标记蛋白质的其它方法也都具有局限性。基于S1型和S11型断裂蛋白质内含子的蛋白质反式剪接是一种新型的具有潜在优势的蛋白质修饰方法。蛋白质反式剪接发生在目标蛋白质的特定位点，因而保证了标记或修饰位点的特异性;此外，这种方法不会在被修饰的蛋白质上残留大的蛋白质标签，而且由于可以在化学合成的多肽外显子上添加任何化学模体，其应用更加具有多样性。不同的蛋白质内含子对于不同蛋白质外显子的剪接效率可能不同，为了更好地实现上述或其它潜在的利用多肽-蛋白质剪接或蛋白质-多肽剪接的应用，人们需要更进一步地探索蛋白质内含子的结构与其功能的奥秘，并且需要获得更多种不同的新型断裂蛋白质内含子以供选择。
　　根据最新的研究报道，蛋白质内含子Ssp DnaX的较大C-端片段(IC)能够发生自发性的C-端断裂反应，而蛋白质内含子SspDnaB的C-端大片段(IC)不具有这一现象。这种C-端断裂反应是人们意料之外的，关于此蛋白质内含子的结构与功能的关系以及蛋白质反式剪接的活性有待进一步研究。在本论文中，我们的研究结果表明，蛋白质内含子SspDnaX的N-端片段(IN)存在时，其IC片段可以与IN发生蛋白质反式剪接反应，而且蛋白质反式剪接反应的活性抑制了C-端断裂反应的活性。此外，本研究发现此IC也能够与来源于另外两种蛋白质内含子的IN发生蛋白质反式剪接反应，表明断裂蛋白质内含子SspDnaX与其它蛋白质内含子存在交叉反应活性。另外，本研究发现即使蛋白质内含子Ssp DnaX的IN被包裹在一个接近完整的蛋白质内含子结构内部，IC仍然能够与之发生蛋白质反式剪接反应，揭示此蛋白质内含子的IN部分可以游离出结构中心的催化口袋，并与IC相互识别。总之，本研究发现了一种非常有价值的可用于多肽-蛋白质反式剪接的新型断裂蛋白质内含子，并且进一步证实了蛋白质内含子结构的灵活性以及此蛋白质内含子在活性位点的交叉反应活性。
　　蛋白质内含子Ssp GyrB非常具有研究价值，因为这个蛋白质内含子可以被改造成非传统型的新型断裂形式即S11型。本研究发现，蛋白质内含子SspGyrB也可以改造成为有活性的S1断裂型，且没有检测到Ssp GyrBS1型断裂蛋白质内含子发生C-端断裂的副产物，这与其它一些发生不同程度副反应的蛋白质内含子相比，具有很大的优势。此外，在Ssp GyrB蛋白质内含子内部添加6×组氨酸标签，不会阻断蛋白质剪接活性，因此，便于含有该蛋白质内含子的融合蛋白通过镍(Ni)亲和层析得到纯化。另外，本研究发现重叠型的SspGyrB蛋白质内含子也有蛋白质反式剪接活性，可能适用于重组蛋白质的可溶性表达与剪接。由于S0型断裂蛋白质内含子的断裂位点在靠近蛋白质内含子结构的中间位置，可能容易对蛋白质内含子的结构造成破坏，经常导致这种断裂蛋白质内含子的其中一个或两个片段与蛋白质外显子形成的融合蛋白错误折叠或可溶性较差。本研究发现的Ssp GyrB重叠型断裂蛋白质内含子是由S11型断裂蛋白质内含子的N-端和S1型断裂蛋白质内含子的C-端组成，即两个片段均是接近完整的蛋白质内含子片段，对蛋白质内含子整体结构的破坏较小，发生错误折叠的可能性相对较低。
　　本论文对另外两种S1型断裂蛋白质内含子Rma DnaB、Ssp GyrB的较大C-端片段分别与不同S1型断裂蛋白质内含子的N-端片段在大肠杆菌内的交叉反应活性进行了分析检测。目的是探讨S1型断裂蛋白质内含子的结构杂交特征是否具有普遍性。结果发现，S1型蛋白质内含子Rma DnaB的C-端片段能够与S1型蛋白质内含子Ssp GyrB的N-端片段交叉反应，不能与S1型断裂蛋白质内含子SspDnaX的N-端片段交叉反应;与此相似，S1型蛋白质内含子Ssp GyrB的C-端蛋片段能够与Rma DnaB的N-端片段交叉反应，不能与Ssp DnaX的N-端蛋片段交叉反应。这表明S1型断裂蛋白质内含子C-端大片段的交叉反应活性具有一定的普遍性，并非Ssp DnaX的C-端大片段独有的特征。此外，某些交叉反应表现出温度依赖性。
　　我们检测了多种杂合断裂蛋白质内含子的交叉剪接反应活性，对S1型、S11型断裂蛋白质内含子的体外交叉反应进行了研究。我们获得了一个包含有多种无交叉反应的S1型断裂蛋白质内含子和S11型断裂蛋白质内含子的数据库，包括多个S1型、多个S11型和多个S1与S11型的混合组合，形成了一个新的同时利用多个断裂型蛋白质内含子的蛋白质反式剪接系统，我们对此系统进行了模拟应用。
　　此系统中多个新型断裂蛋白质内含子在同一体系中的共剪接能够在蛋白质研究及蛋白质工程领域广泛应用。例如在某一体系中，当人们需要同时研究多个蛋白质时，利用多个新型断裂蛋白质内含子共剪接可以实现对多个目标蛋白质的修饰或标记。选择此蛋白质反式剪接系统中的断裂蛋白质内含子，我们成功模拟了两种S11型断裂蛋白质内含子的共剪接、两种S1型断裂蛋白质内含子的共剪接和S11型与S1型断裂蛋白质内含子的共剪接，没有发生非特异性的交叉剪接，证实了此系统至少在本实验环境中的可行性。
　　利用无交叉反应的S11型和S1型断裂蛋白质内含子，还可以进行内部小肽剪接反应，从而将小肽剪接到蛋白质的内部。我们选择了9组上述系统中的S11型和S1型断裂蛋白质内含子的组合进行了内部小肽剪接实验。除了其中一个组合外其余8种组合均成功将小肽剪接到了蛋白质外显子内部。由于中间前体肽较小，容易人工化学合成，在合成过程中可以进行小肽的修饰或标记，通过S11型和S1型断裂蛋白质内含子的剪接反应，小肽被剪接到目标蛋白质的内部。因此，断裂蛋白质内含子在内部小肽剪接方面的应用可以实现在蛋白质内部特异位点的修饰或标记。
　　上述蛋白质反式剪接系统还可以有很多其它方面的应用。例如，此系统可以对蛋白质内部进行同位素探针标记，用于核磁共振(NMR)研究。可以在蛋白质分子两端进行荧光标记或化学修饰（糖基化、磷酸化等）;有些毒性蛋白无法在细胞内完整表达，也有些蛋白质因分子量太大而无法在细胞内表达完整，均可以利用此系统中无交叉反应的断裂蛋白质内含子，将目标蛋白质分多个小段单独表达后通过蛋白质反式剪接有序连接形成完整的蛋白质。荧光能量共振转移(FRET)在生物大分子相互作用分析、细胞生理研究、免疫分析等方面有着广泛的应用。但是这种技术需要为蛋白质添加两个或更多的荧光探针。利用多个S1型或S11型的断裂蛋白质内含子则可以实现对多个蛋白质分子的特异性标记或单个蛋白质分子的多位点特异性标记。
　　本论文主要涉及新型断裂蛋白质内含子的构建，蛋白质内含子结构与功能关系的研究，断裂型蛋白质内含子的杂交反应研究，新的蛋白质反式剪接系统的建立及其应用研究。论文的研究成果使人们对蛋白质内含子有了更多的认识，并且提供了更丰富的蛋白质研究及蛋白质工程的工具和方法，有利于促进生物技术、生物医药和蛋白质化学等领域的发展。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 蛋白质内含子的发现

1．2 蛋白质内含子的分类及结构特征

1．2．1 标准型蛋白质内含子

1．2．2 微小型蛋白质内含子

1．2．3 断裂型蛋白质内含子

1．3 蛋白质内含子催化蛋白质剪接的机制

1．3．1 蛋白质顺式剪接的催化反应机制

1．3．2 蛋白质反式剪接的催化反应机制

1．4 蛋白质内含子的应用

1．4．1 蛋白质的纯化

1．4．2 蛋白质内含子应用于蛋白质的环化

1．4．3 毒性蛋白的生产

1．4．4 蛋白质反式剪接在基因治疗中的应用

1．4．5 蛋白质内含子用于目的蛋白的活性控制

1．4．6 蛋白质内含子介导的表达蛋白质连接

1．4．7 蛋白质内含子用于蛋白质同位素标记

1．5 总结

参考文献

第二章 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 蛋白质内含子

2．1．2 实验菌株

2．1．3 实验试剂

2．1．4 常用试剂的配方与配制方法

2．2 实验技术

2．2．1 大肠杆菌DH5α或BL21(DE3)感受态细胞的制备

2．2．2 质粒的转化方法

2．2．3 质粒的提取

2．2．4 聚合酶链式反应

2．2．5 DNA凝胶回收

2．2．6 DNA酶切与连接

2．2．7 重组蛋白质的诱导表达

2．2．8 蛋白质的纯化

2．2．9 蛋白质内含子的体外剪接

2．2．10 蛋白质变性凝胶电泳(SDS-PAGE)

2．2．11 蛋白印迹实验

第三章 新型断裂蛋白质内含子Ssp DnaX的蛋白质反式剪接与交叉反应

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 表达质粒的构建

3．2．2 蛋白质的表达与纯化、体内或体外反应

3．2．3 蛋白质内含子结构的计算机模拟

3．3 结果

3．4 讨论

参考文献

第四章 断裂型蛋白质内含子Ssp GyrB的蛋白质反式剪接研究

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 表达质粒的构建

4．2．2 蛋白质的表达与纯化、体内或体外反应及检测

4．3 结果

4．4 讨论

参考文献

第五章 多种S1型断裂蛋白质内含子之间的体内交叉反应

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 表达质粒的构建

5．2．2 大肠杆菌体内蛋白质的表达及反应产物检测

5．3 结果

5．4 讨论

参考文献

第六章 应用多种新型断裂蛋白质内含子的体外蛋白质反式剪接系统及应用

6．1 引言

6．2 材料与方法

6．2．1 质粒的构建

6．2．2 蛋白质的表达、纯化与体外反应

6．3 结果

6．4 讨论

参考文献

第七章 结论和展望

7．1 结论

7．2 展望

博士期间发表论文和参加科研情况说明

致谢

附录：符号说明