黄病毒通用引物RT-PCR以及Real-Time PCR方法的建立并应用于蚊虫检测

摘要

黄病毒科 (Family Flaviviridae)共有70余种病毒，其中黄病毒属(GenusFlavivirus)日本脑炎病毒复合组(Japanese encephalitis virus complex)的病毒大多为经蚊虫、蜱等媒介传播的虫媒病毒 (arthropod-borne viruses，arbovirus)，包括乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、登革病毒(Dengue virus，DEN)、黄热病毒(Yellow fever virus，YFV)、西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)，圣路易斯脑炎(St．Louis encephalitis virus，SLE)等。乙型脑炎主要流行于亚洲地区，登革热/登革出血热在亚洲、太平洋地区以及美洲的流行呈明显上升趋势，圣路易脑炎主要分布于北美和南美，西尼罗病毒在阿尔及利亚、俄罗斯、意大利和美国等地发生爆发流行，裂谷热(Rift Valley fever，RVF)自2000年9月首次在传统疫区非洲以外地区——阿拉伯半岛发现疫情。黄病毒属中半数以上的病毒种类能够致人和动物感染，患病率高而治愈率低，容易留下一些严重的后遗症，给人类健康带来很大威胁。 由于黄病毒属病毒所致疾病通过蚊或蜱等吸血媒介传播，大多为人畜共患疾病，并缺乏有效的治疗、预防和控制措施，因而容易导致严重的公共卫生问题，给疾病的预防和控制提出了严峻的挑战。以登革病毒、乙型脑炎病毒以及西尼罗病毒等为代表的黄病毒疫源地的扩大，更引起了世界各国的关注和担忧。此外，国外报道的西尼罗病毒传播媒介种类中，我国存在的种类有二带喙库蚊(麻翅库蚊)(Culex bitaeniorhynchus)、白雪库蚊(白霜库蚊)(Cx．gelidusl)、尖音库蚊复合种Cx．pipiens complex)各蚊种；白纹伊蚊(Aedes albopictus)、日本伊蚊(Ochlerotatusaponicus，骚扰蚊属)、毛跗库蚊(Cx．tarsalis)和埃及伊蚊(Ae．aegypti)、刺扰伊蚊(Ae.vexans)分别是有效和中等有效的媒介。为加强对黄病毒属病毒的研究及其流行病学调查，应对疾病早期预警的需求，亟待建立一套科学、简便、快速的蚊虫黄病毒检测方法。 黄病毒属病毒日本脑炎复合组属于正链RNA病毒。以西尼罗病毒为例，长度约11 kb，其病毒基因组RNA在5'端有一个Ⅰ型帽状结构(m<'7>GpppAmp)，3'端缺少聚腺苷酸序列，以CU-OH结尾。病毒基因组RNA可以直接作为mRNA从一个开放阅读框内翻译出一条长链前体蛋白，长链前体蛋白被切割成至少十种成熟的蛋白，其中包括三种结构蛋白(C、prM和E蛋白)与七种非结构蛋白。这些蛋白在病毒基因组上的编码顺序为：C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5。其中NS5段是所有黄病毒属病毒基因组的保守结构域。本研究即基于此保守结构域建立一套以RT-PCR为基础的黄病毒属特异性检测方法，在有阳性检测结果的基础上，再用病毒种特异性引物进一步鉴定病毒。 首先，将JEV (JEV SA14-14-2减毒活疫苗)接种于乳鼠脑，解剖濒死乳鼠取脑，以此乳鼠脑的病毒悬液为抽提样本；根据黄病毒属病毒的保守结构域NS5段设计引物，对JEV减毒活疫苗病毒液逆转录cDNA，同时取登革病毒cDNA进行PCR扩增，所获扩增片断与预期片段大小一致，验证了其引物的通用性；该RT-PCR方法的敏感性达到0.568 PFU/ml。在此基础上，建立了基于此对通用引物、SYBR Green Ⅰ标记的Real-Time PCR检测方法，并用于检测野外采集的蚊媒标本。 由于西尼罗病毒已经在全球许多国家(包括我国周边国家)造成流行，可能会由迁飞的鸟类携带、扩散，西尼罗病毒传入我国的风险很大，因而我国将该病毒列入可能传入的新现传染病病原体。在“十五”国家科技攻关项目：“新发寄生虫病媒介生物学监测与预警系统的研究”资金资助下，本研究进一步建立鉴别WNV的检测方法。根据文献报道，E蛋白是西尼罗病毒主要的抗原结构蛋白，具有高度保守性。人工合成E蛋白基因片段，连接到pMD18-T和pMD19-T载体转化大肠杆菌，鉴定阳性质粒，以此质粒为模板的PCR产物作为TaqMan探针实时PCR(Real-Time PCR)方法的阳性对照。将此PCR产物原液系列对数稀释<'1>，Real-Time PCR 可检测的最低稀释度为1∶10<'8>，经测定PCR产物的OD值，敏感度达到1 fg；而常规RT-PCR 检测结果显示，反应敏感度为1∶10<'7>(0.01 pg)。可见Real-Time PCR的敏感性比常规RT-PCR 高10倍。以此方法还可以对蚊媒体内的病毒进行半定量。 基于以上建立的检测方法，选择江苏、福建、云南、上海、新疆5个省、市、自治区的候鸟迁徙地、湿地自然保护区作为蚊媒观察点采集蚊虫，并在新疆选点捕杀野鼠取其脏器进行RT-PCR和Real-Time PCR检测。将饱血蚊虫按照30只分为一个混合样本组，样本少时则每组少于30只；非饱血蚊虫50～60只为一混合样本组；取野鼠脏器(肝、脾、脑)0.5 cm<'3>为一样本组。共检测蚊虫样本组261组，12539只，野鼠脏器样本8组。用上述黄病毒属通用引物RT-PCR扩增，在江苏沿海某湿地采集的蚊虫有阳性扩增，进一步用病毒种特异性引物进行RT-PCR扩增，仅乙脑病毒特异性引物有阳性扩增，而登革病毒和西尼罗病毒特异性引物扩增阴性。对扩增产物序列测定，该阳性扩增序列与乙型脑炎病毒基因序列一致。用SYBR Green Ⅰ染料Real-Time PCR法对上述269组样品进行检测，有22组蚊虫样本有阳性扩增曲线，这些标本分别是从上海、江苏、福建、云南和新疆5省的采集点捕获。进一步对这些阳性扩增样本用TaqMan探针Real-Time PCR进行西尼罗病毒的鉴定，未见阳性扩增曲线，证明是非西尼罗病毒的黄病毒感染。进一步的鉴定工作仍在进行中。从蚊媒方面来监测病毒感染，在传染病监测中属于早期监测、早期预测传染病即将发生流行的方法。本研究针对检测蚊媒中的黄病毒属日本脑炎病毒组感染建立了一套简单、有效、快速的检测方法，该方法可用于大批量的检测野外采集的蚊虫。经现场蚊虫检测，在江苏沿海某湿地自然保护区采集的蚊虫体内发现日本脑炎病毒，在其他蚊虫采集地区用SYBR Green Ⅰ染料Real-Time PCR法也检测到蚊虫体内低水平的黄病毒，该研究结果应当引起疾病控制部门的重视，并对这些地区以及其他类似地区进行进一步的监测；同时本实验建立的监测方法也为虫媒病毒监测以及可能传入我国的新型虫媒病病原体的检测以及预警提供了实验资料。

目录

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

第一部分建立黄病毒属检测的RT-PCR方法和SYBR Green Ⅰ Real-Time PCR方法

第二部分建立TaqMan探针Real-Time PCR方法检测WNV

第三部分RT-PCR方法和SYBR Green ⅠReal-Time PCR方法检测野外采集标本

小结和展望

参考文献

致谢

综述：蚊媒感染日本脑炎复合病毒检测技术研究进展