糖皮质激素对大鼠原代肝细胞糖原代谢的双向调节作用

摘要

本文采用“两步灌流法”分离大鼠肝细胞，于William's E Medium+10％FBS培养液中培养，倒置相差显微镜下观察原代培养肝细胞形态学变化，全自动生化分析仪检测培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、白蛋白(Alb)及尿素(Ureal)含量；糖苷酶降解结合己糖激酶法葡萄糖测定检测GCs对大鼠肝细胞内糖原含量的影响；酶反应动力学分析法检测GCs对大鼠肝细胞糖原代谢的关键酶糖原磷酸化酶和糖原合酶活性的影响；放射免疫分析法检测GCs对大鼠肝细胞胞内cAMP水平的影响；Fluo-3/AM荧光扫描技术检测GCs对大鼠肝细胞胞浆游离钙浓度[Ca<'2+>]i的影响。研究工作取得的主要结果如下： 1．通过形态学及台盼蓝染色法鉴定，分离的肝细胞胞膜完整，呈球形或椭球形，存活率在90％以上。培养后贴壁牢固，生长状态良好，生化检测培养上清液中LDH、白蛋白、尿素水平显示，损伤逐渐恢复，合成及分泌功能良好，说明该方法是比较理想的肝细胞培养法，为实验研究提供了稳定的细胞模型平台。 2．地塞米松处理原代培养肝细胞24 h，低浓度(10<'-10>-10<'-9>M) GCs可显著增加肝细胞糖原含量，而较高浓度(10<'-8>-10<'-5>M)则显著降低肝细胞糖原含量，并呈剂量依赖性。考虑到高浓度GCs细胞毒作用的可能，采用Cell Counting Kit-8法检测细胞活力，结果也排除了细胞毒作用可能的影响。 3．以10<'-6>M地塞米松处理原代培养肝细胞，观察细胞内糖原含量的变化，发现2 h后地塞米松处理组较对照组细胞内糖原含量显著降低，48 h后逐渐恢复并于72 h后高于对照组。蛋白合成抑制剂放线菌酮不能阻断地塞米松的降低糖原含量作用(6 h)。 4．以10<'-6>M地塞米松处理原代培养肝细胞，15 min后细胞内糖原磷酸化酶α活性处理组较对照组显著增高，2 h后逐渐恢复并于6 h及其以后低于对照组，而糖原合酶活性在6 h及24 h显著降低。 5．以10<'-6>M地塞米松处理原代培养肝细胞，胞内cAMP水平在6 h及24 h显著升高，地塞米松还能在数秒内迅速升高肝细胞[Ca<'2+>]i水平。 以上结果表明，GCs对大鼠肝细胞的糖原代谢存在双向调节作用，高浓度GCs在相对较短的时间内可以通过影响糖原磷酸化酶和糖原合酶活性而使肝细胞内糖原含量下降。该作用可能有着非基因组机制的参与，并与GCs快速升高胞内游离钙以及其影响胞内cAMP水平有关。 GCs对糖原代谢的作用是双向的，推测该作用可能在机体应激反应中具有重要的生理意义。GCs因其浓度不同作用有所差别，正常状态下GCs能促进肝糖原的合成，而应激状态下GCs在增加糖异生的同时促进肝糖原分解以应对机体对葡萄糖的需要。此外，GCs在应激的不同阶段也可能发挥不同的调节作用。在强烈应激的早期阶段，GCs可能促使储备的肝糖原分解，而其后GCs促进糖原合成补充急性消耗的肝糖原以防备下次应激。 因此，本研究对GCs在糖代谢中的作用提出了新的模式，为研究GCs特别是其非基因组机制在应激中的生理意义提供了参考依据。

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综述 糖皮质激素非基因组机制研究进展

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