新型N-取代氨基-4-苯磺酰胍衍生物和5-硝基-1H-吲唑-3-羧酸类精子顶体酶抑制剂的设计、合成及活性评价

摘要

目前世界人口已突破70亿大关，人口的快速增长对社会和经济的发展都增加了沉重的负担。我国是人口大国，计划生育是我国的基本国策。在当今妇女地位不断提高的前提下，越来越多的女性强烈地要求男性在享受避孕带来好处的同时也要承担相应的责任。但是迄今为止，临床上还没有男性抗生育药物使用的记录，因此，研发高效、可逆、安全、方便的男用避孕药成为时代的需要。
　　 附睾是男性生殖系统的重要组成部分，对于精子的成熟、贮存和保护起着决定性的作用。顶体是精子的核心结构，作为一种特化的溶酶体，它含有多种与受精相关的酶。顶体酶不仅影响精子活力、促进精子运动，还能在受精过程中分散顶体基质，水解卵细胞透明带，形成一条通路，促使精子进入卵细胞，与卵子融合，完成受精过程，因此顶体酶成为了近年来研究的热点靶点。
　　 现有的顶体酶抑制剂不多，大都由随机筛选得到，而且大部分存在着毒性大，专一性差或化学性质不稳定等的问题。此外，由于抑制剂与靶酶结合模式等相关信息的缺乏，基于靶酶结构的顶体酶抑制剂的研究开发进展比较缓慢。
　　 在前期工作中，本课题吕加国等人首次采用同源模建的方法得到了人顶体酶三维结构，并对其活性腔进行了分析，发现顶体酶的活性腔是一个不规则的凹槽，将其划分为P1、P2和G三个活性区域，其中P1是配体结合的重要极性区域；此外，P1和G边缘及P2底部还有一定的疏水性，各个腔内均分布有多种关键的氨基酸残基，如T216、Q218、S221、R199、E120、G128等。
　　 本研究中，我们设计并合成了两类人精子顶体酶抑制剂，分别为N-取代氨基-4-苯磺酰胍衍生物和5-硝基-1H-吲唑-3-羧酰胺类结构的化合物。
　　 其中第一类化合物的设计是根据现有的大部分抑制剂和高活性化合物KF950的作用模式得来的，经对接我们发现其胍基均位于P1腔，并和P1腔形成多对氢键结合作用，我们推测这是其高活性的主要原因，表明胍基是重要的药效团结构，因此作为保留基团。但是KF950有其理化性质方面的不足，因此我们在保留胍基的基础上引入了可以增强稳定性的基团酰胺键以及增强脂溶性的基团磺酰基，设计合成了一类新型的N-取代氨基-4-苯磺酰胍类人精子顶体酶抑制剂。按照所设计的路线，以对硝基苯磺酰氯为原料经两步合成中间体N-取代氨基-4-苯磺酰胍；然后与不同的取代酰氯反应得到目标物，共合成35个目标化合物，所有的化合物均为首次报道。中间体和目标化合物均经1HNMR、13CNMR和MS确证。
　　 第二类化合物是根据相关的文献报道和活性腔的性质所设计的，由文献调研我们发现1H-吲唑-3-羧酸衍生物有抗精子生成的作用，将其与我们的项体蛋白进行计算机对接发现该先导物母核位于P1腔腔口，但缺乏和P1腔有氢键结合作用的极性基团，因此我们选择在疏水的芳环上引入硝基，对接后我们发现该基团能和P1腔形成稳定的氢键结合作用。为使分子能延伸至P2和G腔中，我们选择在可修饰基团羧基处进行衍生，设计合成了一类5-硝基-1H-吲唑-3-羧酰胺类项体酶抑制剂。根据文献报道，我们设计了以下合成路线：以β-乙酰苯肼为起始原料，分别与水合氯醛，盐酸羟胺、无水硫酸钠经过三步反应得到关键中间体1H-吲唑-3-羧酸，然后在浓硫酸和硝酸钾的作用下生成中间体5-硝基-1H-吲唑-3-羧酸，最后与各类取代胺反应得到目标化合物，共计21个，所有的化合物均为首次报道。中间体和目标化合物均经1HNMR和MS确证。
　　 我们在前人的基础上改进了化合物的抑酶测试方法，对合成所得化合物进行体外活性测试。实验结果表明所有化合物均有较强体外抑酶活性，活性最好的化合物IC50达到了0.01μmol/ml，有进一步开发的价值。根据活性测试的结果，我们对所合成的化合物进行了初步的构效关系分析，为进一步研究提供了参考。
　　 本课题通过对人顶体酶活性位点优化设计研究，进一步完善了基于人顶体酶活性位点设计新型抑制剂的设计平台；基于人顶体酶活性位点性质以及KF950结构特征，合理优化设计得到亲和力、化学稳定性有较大改善的特异性N-取代氨基-4-苯磺酰胍和5-硝基-1H-吲唑-3-羧酰胺类新型人精子顶体酶抑制剂。合成了先导化合物的系列衍生物，体外测试了所合成目标化合物抑制人精子顶体酶活性；两类化合物中分别获得的高效顶体酶抑制剂化合物4p和6d可作为候选物进一步开发研究。