肝X受体在抑制草酸钙结石肾钙斑形成中的作用及机制研究

摘要

泌尿系结石是一种高度流行的全球性疾病。中国是结石高发国家之一，近年来的流行病学调查显示我国的发病率有逐年增加的趋势。泌尿系结石的复发率每年可高达10%~23%，如果没有采取有效的内科预防和治疗措施，5年内复发率可达50%。随着医疗器械的发展更新，肾结石的手术治疗技术在过去20年间已有了长足的进展。但是，基于结石形成机制的研究却仍相当匮乏，缺乏有效的药物来预防和控制结石的发生和复发。因此，对尿石症形成机制的研究具有重要的临床意义。 在过去的十年中，一系列研究强调了乳头端磷酸钙沉积作为草酸钙（CaOx）结石形成的起点，称为兰德尔氏肾钙斑（Randall’s plaque）。不同种类的肾结石患者当中，肾脏内存在着钙斑的比率分别为磷酸钙和尿酸盐结石(100％)、草酸钙结石(88％)、胱氨酸结石(33％)、磷酸镁铵结石(20％)。肾钙斑是在肾乳头顶端髓袢细段基底膜形成的非炎性上皮下磷酸钙沉积物，并在靠近乳头上皮的集合管周围的间质中扩大。目前大量研究已经表明草酸钙结石的形成和进展与兰德尔氏肾钙斑关系密切。通过对先天性草酸钙结石及非草酸钙结石患者肾钙斑斑块面积测量发现，肾钙斑的面积大小和数量直接与尿路结石形成数量成正比。既往的研究显示肾钙斑占肾乳头面积低于5%的特发性草酸钙结石患者反复结石发作的比例为22%，显著低于高肾钙斑组患者（80%），提示减少肾钙斑形成可能有助于减少结石形成和复发。 肝X受体（Liver X receptors，LXRs）是胆固醇代谢物氧固醇的核受体靶标，属于核受体家族成员之一。LXRs通常需要视黄醇类X受体（RXR）的配合，两者互相结合形成异二聚体结构才能产生生理作用。LXRs能够参与机体多种生理活动的调节，包括脂肪代谢、糖代谢以及调节炎症反应过程等。LXRs包括LXRα和LXRβ两种同源亚型，在肾组织中均有表达。通过对特发性草酸钙结石患者肾乳头活检组织进行RNA微阵列分析，发现高肾钙斑组的肾组织LXR/RXR信号通路存在显著抑制。因此推测LXR/RXR可能是调节肾钙斑形成的重要因子。 肾钙斑中无机成分主要为羟基磷灰石，有机成分则主要为骨桥蛋白（OPN）。OPN是分泌到细胞外基质中的磷酸化糖蛋白，被认为在生物矿化过程中发挥重要作用，特别是在一系列病理条件下（例如动脉粥样硬化、乳腺癌、牙结石和肾结石等）。体外研究显示OPN通过其保守的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸结构域促进CaOx晶体粘附和体外聚集。现有研究表明，氧化应激、脂质过氧化及炎症介质等因素与肾钙斑形成相关。OPN在细胞介导的免疫反应中也起着关键作用，其被巨噬细胞大量合成和分泌，并作为促炎细胞因子起作用，在炎症部位招募和激活免疫细胞。晚近关于肾钙斑相关基因的研究通过免疫电镜观察，发现OPN在肾钙斑里及其周围表达，并指出上调的OPN水平与肾钙斑的生长密切相关，该研究指出了OPN和肾钙斑的直接相关性。在糖尿病肾病模型小鼠的研究中，LXRs激动剂治疗可显著降低糖尿病肾病中的关键促炎性细胞因子OPN的表达以及肾组织巨噬细胞浸润。 目的:本研究中，首先通过检测特发性草酸钙结石患者肾乳头肾钙斑活检组织中LXRs的表达水平，以及一水草酸钙（COM）诱导的肾小管上皮细胞和草酸钙结石模型小鼠肾组织中LXRs、OPN表达变化，探索LXRs与肾钙斑的相关性；利用不同慢病毒载体分别上调/下调不同亚型LXRs表达水平，观察对肾钙斑形成和OPN表达的影响；为进一步证实氧化应激和炎症反应在LXR调节肾钙斑形成中的作用，检测了体外体内草酸钙结石模型中氧化应激和炎症反应的水平，并探索了丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路在其中的作用，初步阐述了LXRs调节肾钙斑形成的作用及机制，为临床治疗泌尿系结石提供新的靶点和思路。 方法: （一）检测LXRs在草酸钙结石肾钙斑中的表达特点 1.通过RNA微阵列分析检测特发性草酸钙结石患者肾乳头活检组织中RNA表达谱特点。 2.利用qRTPCR和Western blot验证特发性草酸钙结石患者肾乳头活检组织中LXRs表达变化。 3.通过COM培养肾小管上皮细胞HK-2建立体外草酸钙结石模型，Von Kossa染色检测细胞钙结晶形成水平；qRTPCR和Western blot检测LXRs表达水平。 4.通过腹腔注射乙醛酸盐建立草酸钙结石模型小鼠，H&E染色观察肾组织病理损伤情况；偏折光显微镜观察肾组织中结晶沉积情况；Von kossa及茜素红染色检测肾钙斑形成情况。 5.qRTPCR、Western blot、免疫组化检测草酸钙结石模型小鼠肾组织LXRs表达水平。 （二）调控LXRs表达对肾钙斑形成的影响 1.LXRs激动剂T0901317激活LXRs，利用qRTPCR和Western blot检测HK-2细胞LXRs、OPN表达水平变化；Von Kossa染色检测细胞钙结晶形成水平。 2.通过慢病毒过表达载体pCDH-CMV-EF1-copGFP构建LXRα和LXRβ过表达质粒，经过病毒纯化后感染HK-2细胞，利用qRTPCR和Western blot检测分别上调不同亚型LXR表达后，对细胞LXRs、OPN表达水平变化；Von Kossa染色检测细胞钙结晶形成水平。 3.通过慢病毒表达载体pLKO.1-puro构建LXRαshRNA和LXRβshRNA质粒，并转染HK-2细胞，利用qRTPCR和Western blot检测分别抑制不同亚型LXR表达后，对细胞LXRs、OPN表达水平变化；Von Kossa染色检测细胞钙结晶形成水平。 4.给予草酸钙结石模型小鼠LXRs激动剂T0901317，Von kossa及茜素红染色检测肾钙斑形成情况；qRTPCR、Western blot、免疫组化检测草酸钙结石模型小鼠肾组织LXRs及OPN表达水平。 （三）调控肝X受体对草酸钙结石炎症反应和氧化应激的作用 1.体外草酸钙结石模型中，采用流式检测细胞内活性氧（ROS）产生情况，qRT PCR检测炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）转录水平，TUNEL染色检测细胞凋亡情况。 2.分别上调及抑制LXRα和LXRβHK-2细胞表达，采用流式细胞仪检测细胞内ROS产生情况，qRT PCR检测炎症因子TNF-α和MCP-1转录水平，TUNEL染色检测细胞凋亡情况。 3.采用Western-blot、免疫组化检测各组HK-2细胞、草酸钙结石模型小鼠肾组织磷酸化及非磷酸化p38和c-jun表达差异。 结果: （一）LXRs表达与草酸钙结石肾乳头肾钙斑形成呈负相关 1.RNA微阵列分析显示在特发性草酸钙结石患者中，与低肾钙斑组相比，高肾钙斑组的患者LXR/RXR被明显抑制。qRTPCR和Western blot证实高肾钙斑组肾乳头活检组织中LXRs表达显著下调。 2.草酸钙结石体外细胞模型中，qRTPCR和Western blot显示COM浓度在1mM时LXRα和LXRβ水平均显著下调，OPN表达增加。 3.草酸钙结石模型小鼠中，qRTPCR、Western blot和免疫组化均显示肾组织LXRα和LXRβ表达减少，OPN表达明显增加。 （二）调控LXRs表达对肾钙斑形成的影响 1.T0901317非选择性激活LXRs或分别上调LXRα和LXRβ过表达后，均能够明显抑制细胞钙结晶的形成，抑制OPN表达。 2.分别抑制LXRα和LXRβ表达后，均能够促进细胞钙结晶形成，上调OPN表达，不存在亚型特异性。 3.LXRs激动剂T0901317能够上调草酸钙结石模型小鼠肾组织LXRs表达，抑制OPN表达，茜素红和Von Kossa染色显示肾组织中磷酸钙沉积减少。 （三）调控肝X受体对草酸钙结石炎症反应和氧化应激的作用 1.激活LXRs能够抑制HK-2细胞的ROS水平以及炎症反应，削弱COM诱导的HK-2细胞凋亡。 2.分别抑制LXRα和LXRβ表达，能够消除LXRs对ROS水平、炎症反应以及细胞凋亡的抑制。 3.Western blot结果显示，COM能够明显激活JNK和p38MAPK信号通路，促进p38和c-jun磷酸化，而T0901317能够抑制COM引起的JNK和p38MAPK信号激活。此外，干扰LXRα和LXRβ能够消除T0901317对COM所激活的JNK和p38MAPK信号的抑制作用。 4.草酸钙结石模型小鼠中，激活LXRs能够抑制p38和c-jun的磷酸化，提示p38MAPK和JNK信号可能参与到LXRs对肾钙斑的调节中。 结论: 1.LXRs在草酸钙结石肾乳头肾钙斑中表达下调。 2.激活LXRs能够减少肾钙斑形成，下调OPN表达，而抑制LXRs表达会加重肾钙斑形成，LXRα和LXRβ的作用不存在亚型特异性。 3.激活LXRs能够抑制肾乳头肾小管细胞氧化应激和炎症反应，从而减少肾钙斑形成和OPN表达。P38-MAPK和JNK信号通路可能参与其中。

目录

第一个书签之前