CRISPR/Cas9系统中Cas9蛋白DNA结合域及sgRNa-shRNA阵列表达研究

摘要

CRISPR/Cas9是新近开发的一种基因编辑技术，由两部分组成，非特性的核酸酶Cas9蛋白和一个小片段导向RNA。鉴于CRISPR/Cas9系统结构简单，容易操作以及较高的基因组切割效率，已经被广泛应用于各种生物的基因组编辑研究中。Cas9核酸酶在导向RNA的引导下，能够特异性的结合到基因组的靶位点，并在PAM序列的配合下，对靶位点进行双链切割。解析Cas9蛋白中DNA结合域对改进Cas9核酸酶活性以及开发新的基因编辑系统具有重要的意义。本研究首先将非特异性核酸酶Fok1与Cas9基因进行融合，然后对Cas9基因从两端进行截短突变，结合双荧光报告载体系统，在293T细胞中对相关突变体进行功能验证。以期发现Cas9蛋白中DNA的结合功能域。同时针对CRPISPR/Cas9系统中sgRNA的表达，在前期研究的基础上进一步提出了Cys4介导的sgRNA-shRNA阵列表达策略，期望改进和提高本实验室所开发的多重sgRNA及shRNA阵列表达技术。
　　首先，设计了8个不同长度截短的Cas9基因突变体，并将这些突变体以及全长Cas9分别与FokⅠ融合构建了相应的sgRNA/Cas9-FokⅠ表达载体。鉴于FokⅠ需要形成二聚体才具有切割活性，为了验证分析不同sgRNA/Cas9-FokⅠ的功能，进一步构建了含有双sgRNA靶序列（均含有/不含PAM位点）的SSA-DsRed/eGFP双荧光报告载体。将9种不同的sgRNA/Cas9-FokⅠ表达载体分别与靶序列含PAM或不含PAM的SSA-DsRed/eGFP双荧光报告载体共转染293T细胞，通过荧光观察和流式细胞仪计数分析可以评估不同sgRNA/Cas9-FokⅠ的活性，进而分析确定Cas9蛋白的DNA结合域以及其对靶序列PAM的依赖性。在初步的sgRNA/Cas9-FokⅠ活性验证实验中，发现全长Cas9实验组仍具有活性，但是仅局限于靶序列含PAM的报告载体;而两端截短Cas9的实验组均不具备活性，说明Cas9蛋白两端区域均影响sgRNA/Cas9复合体对靶序列的识别作用，同时PAM也是该识别作用所必须的。
　　其次，以Csy4识别序列为间隔设计并构建了新型的sgRNA-shRNA/Cas9表达载体VLC-Csy4/Cas9（含VEGF.sgRNA、LIG4.shRNA和CCR5.sgRNA）及对照载体VCC-Csy4/Cas9(含VEGF.sgRNA、对照CON.shRNA和CCR5.sgRNA)。结合实验室现有的针对VEGF.sgRNA和CCR5.sgRNA的SSA-DsRed/eGFP双荧光报告载体，通过细胞转染实验，初步证明VLC-Csy4/Cas9中表达的sgRNAs均具有较高的活性。进一步通过qRT-PCR实验对VLC-Csy4/Cas9中表达的LIG4.shRNA进行活性鉴定，结果表明LIG4基因的表达量与VCC-Csy4/Cas9对照组相比被敲低40％以上，比实验室前期开发的基于Drosha的sgRNA-shRNA系统有了显著性提高。初步证明了Csy4介导的sgRNA-shRNA阵列表达技术的可行性，为以后进一步的优化和应用研究奠定了基础。

目录

论文说明

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 基因编辑技术

1．2 CRISPR／Cas9技术

1．2．1 CRISPR／Cas系统简介

1．2．2 CRISPR／Cas9技术工作原理

1．2．3 CRISPR／Cas9技术的广泛应用

1．2．4 Cas9的优化研究

1．2．5 核酸酶活性报告系统

1．3 DSB的修复机制

1．4 Csy4介导的多sgRNA表达

1．5 本研究的目的和意义

第二章 CRISPR／Cas9系统中Cas9蛋白DNA结合域研究

2．1 实验原理

2．2 实验材料

2．2．1 主要载体，实验细胞及感受态菌株

2．2．2 主要试剂

2．2．3 配制试剂

2．2．4 主要仪器

2．3 实验方法

2．3．1 sgRNA／Cas9-FokI系列载体构建

2．3．2 SSA-DsRed／eGFP双荧光报告载体构建

2．3．3 Cas9蛋白DNA结合域分析

2．3．4 sgRNA／Cas9-FokI系统PAM依赖性检测

2．4 结果分析

2．4．1 相关载体的构建结果

2．4．2 Cas9蛋白DNA结合域分析

2．4．3 sgRNA／Cas9-FokI系统PAM依赖性检测

2．5 讨论

2．6 小结

第三章 Cys4介导的sgRNA-shRNA阵列表达技术研究

3．1 实验原理

3．2 实验材料

3．2．1 主要试剂

3．2．2 配制试剂与主要器材

3．3 实验方法

3．3．1 相关载体构建

3．3．2 相关sgRNA活性验证

3．3．3 LIG4．shRNA活性检测

3．4 结果分析

3．4．1 相关载体的构建结果

3．4．2 相关sgRNA活性的验证结果

3．4．3 LIG4．shRNA活性的检测结果

3．5 讨论

3．6 小结

4．1 结论

4．2 主要创新点

参考文献

附录

缩略词

致谢

作者简介