低温胁迫下中国野生山葡萄和欧洲葡萄的转录组分析

摘要

葡萄是世界上重要的经济果树，也是我国栽培最为广泛的果树之一。目前我国广泛栽培的欧亚种葡萄，品质优良，但抗寒性差。我国西北地区的气候、土壤条件适宜葡萄种植，但是由于冬季气候寒冷，多需要埋土防寒，给生产带来极大不便。因此，培育抗寒品种是解决生产问题的根本。我国拥有丰富的野生葡萄资源，其中山葡萄是葡萄属中最抗寒的种，可耐-40℃的低温，是非常重要的抗寒基因资源，克隆和研究山葡萄的抗寒相关基因对揭示其抗寒分子机制和进行抗寒分子育种具有重要意义。本研究以抗寒性强的中国野生山葡萄株系‘双优’和抗寒性差的欧洲葡萄品种‘红地球’为试验材料，利用转录组测序技术，筛选低温胁迫不同时间点的差异表达基因，通过生物信息学分析获得山葡萄中抗寒相关的关键基因，通过 qRT-PCR 进一步分析验证抗寒关键基因的表达情况。获得的主要结果如下： 1. 对山葡萄‘双优’和欧洲葡萄‘红地球’进行0℃低温胁迫3、12、48和72h，以室温下取样作为对照（0h），比较二者低温胁迫下理化指标的差异。结果表明：随着处理时间的延长，2种葡萄相对电导率（electrolyte leakage，EL）和丙二醛（malondialdehyde， MDA）含量均呈上升趋势，在相同处理时间下‘双优’EL和MDA含量均低于‘红地球’；脯氨酸含量先下降后上升再下降，0和48h时‘双优’脯氨酸含量高于‘红地球’， 3、12和72h 时‘双优’脯氨酸含量低于‘红地球’。过氧化氢酶（catalase，CAT）活性呈波浪形变化，抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化物酶（peroxidase，POD）活性总体呈现先上升后下降的趋势。除48h外，在其他处理时间点，‘双优’CAT酶活性高于‘红地球’。除72h 外，在其他处理时间点，‘双优’SOD 酶活性高于‘红地球’。在所有处理时间点，‘双优’APX酶活性低于‘红地球’，POD酶活性高于‘红地球’。综合上述7项理化指标表明‘双优’抗寒性强于‘红地球’。 2. 在低温胁迫处理后不同时间点，取‘双优’和‘红地球’叶片提取 RNA，构建cDNA 文库并进行转录组测序，鉴定出 5992 个差异表达基因，其中包括发掘的新基因796个。同一品种在不同胁迫时间与对照比较，在低温胁迫3、12、48和72h时‘双优’的差异基因数分别为32、1161、1894、3290个；‘红地球’的差异基因数分别为240、310、1072、1107个；在相同低温胁迫时间下比较，‘双优’与‘红地球’的差异表达基因数分别为1059、519、1713、1414、1215个。 3. GO富集分析发现，‘双优’差异基因主要富集在冷响应、几丁质响应、茉莉酸介导的信号通路、植物型过敏调控响应、膜蛋白定位、脱落酸激活信号通路、茉莉酸响应等生物学进程；‘红地球’差异基因主要富集在冷响应，几丁质响应，机械刺激响应，细胞内信号转导，脱落酸激活信号通路，伤害响应，重力响应以及查耳酮生物合成等生物学进程。KEGG 富集分析，在响应低温胁迫过程中，‘双优’差异表达基因主要参与谷胱甘肽代谢、植物昼夜节律、类黄酮类生物合成、光合作用以及植物激素信号转导等通路；‘红地球’差异表达基因主要参与植物激素信号转导、植物病菌互作、植物昼夜节律、类黄酮类物质合成和氨基苯丙酸代谢等通路。 4. 挑选12个抗寒相关候选基因进行qRT-PCR分析，其中8个基因的表达趋势与转录组测序结果完全一致，4个基因的表达趋势与转录组测序结果基本一致，表明了转录组测序的可靠性。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 引言

1.2 植物抗寒性研究进展

1.2.1 低温对植物的影响

1.2.2 植物抗寒性机理研究

1.2.3 植物抗寒基因研究进展

1.3 植物转录组测序

1.4 葡萄抗寒性研究进展

1.5 研究基础

1.6 本研究的目的意义

第二章 中国野生山葡萄与欧洲葡萄在低温胁迫下生理应答差异

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 植物材料

2.2.2 试验方法

2.3 结果与分析

2.3.1 低温胁迫温度的筛选

2.3.2低温胁迫对2种不同基因型葡萄生理生化指标的影响

2.4 讨论

第三章 低温胁迫下中国野生山葡萄与欧洲葡萄差异表达基因分析

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 试验材料和低温胁迫处理

3.2.2 叶片总RNA的提取

3.2.3 cDNA文库构建和测序

3.2.4 原始测序数据和质量评估

3.2.5转录组数据分析

3.2.6 反转录

3.2.7 实时荧光定量PCR验证

3.3 结果与分析

3.3.1 原始数据处理结果统计

3.3.2参考基因组比对结果

3.3.3 低温胁迫下两材料差异表达基因的总体特征

3.3.4 生物信息学分析

3.3.5 低温胁迫下差异基因实时荧光定量PCR的验证

3.3.6转录因子

3.3.7 光合相关基因

3.3.8 渗透有机物质相关基因

3.3.9 钙信号途径相关基因

3.3.10 ROS相关基因

3.3.11 植物激素信号转导

3.4 讨论

第四章 结论

参考文献

附录

致谢

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