IHNV-N蛋白和IPNV-VP2蛋白抗血清的制备与应用

摘要

传染性造血器官坏死病毒（Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV）和传染性胰腺坏死病毒（Infectious pancreatic necrosis virus，IPNV）分别是传染性造血器官坏死病和传染性胰腺坏死病的病原。这两种病毒主要感染鲑、鳟鱼类，引发相应临床疾病并导致鱼类极高的死亡率，给鲑、鳟鱼水产养殖业带来了巨大的经济损失。尽管针对IHNV和IPNV的疫苗已在许多国家商业化，但在现代水产养殖中，IHNV和IPNV的流行仍然很普遍。 本研究通过RT-PCR方法克隆了IHNV-N基因，构建了pTriEx-N重组表达载体。将重组表达载体pTriEx-N与杆状病毒线性化的Bacmid DNA共转染Sf9细胞收获重组病毒，然后利用杆状病毒表达载体系统表达并分离纯化了IHNV-N目的蛋白。同时通过重叠PCR的方法从头合成了IPNV-VP2基因，构建了pTriEx-VP2重组表达载体，然后经过大肠杆菌原核表达系统表达并分离纯化得到所需的IPNV-VP2目的蛋白。将纯化的IHNV-N蛋白和IPNV-VP2蛋白分别注射免疫家兔，制备了抗血清。 血清效价检测结果显示，IHNV-N蛋白抗血清稀释度达到1/1000时，其OD450值仍大于阴性血清数值的2.1倍以上，可认定为阳性；而IPNV-VP2蛋白抗血清稀释度达到1/2000时，其OD450值仍大于阴性血清数值的2.1倍以上，可认定为阳性。两种抗血清之间无交叉性反应，表明特异性良好。组织样品检测结果显示，制备的IHNV-N抗血清可以用于IHNV感染虹鳟的快速检测。本研究制备的高效价的抗血清为IHN及IPN病毒感染提供了免疫学检测试剂，同时为鲑、鳟鱼病毒疫情的监测及有效防控奠定了基础。

目录

论文说明

声明

第一章 文献综述

1.1 IHNV概述

1.1.1 IHNV简介

1.1.2 IHNV基因组特征及编码蛋白

1.1.3 IHNV基因型研究

1.1.4 IHNV宿主及临床特征

1.1.5 IHNV疫苗的研究现状

1.2 IPNV概述

1.2.1 IPNV简介

1.2.2 IPNV基因组特征及编码蛋白

1.2.3 IPNV形态学特征和理化特性

1.2.4 IPNV宿主及临床特征

1.2.5 IPNV国内外流行现状

1.3 鱼类病毒检测方法

1.3.1 细胞培养分离法

1.3.2 分子生物学检测法

1.3.3 免疫学检测法

1.4 选题的目的及意义

第二章 IHNV-N蛋白的表达和纯化

2.1 材料与试剂

2.1.1 质粒、细胞和细胞系

2.1.2 工具酶与主要试剂

2.1.3 主要溶液配方

2.1.4 主要使用仪器

2.2 方法

2.2.1 引物设计

2.2.2 IHNV-N基因的扩增

2.2.3重组质粒pTriEx-N的构建

2.2.4 IHNV-N蛋白的原核表达

2.2.5 IHNV-N蛋白的真核表达

2.3 结果与分析

2.3.1 IHNV-N基因的PCR扩增结果

2.3.2载体pTriEx-1.1的双酶切

2.3.3重组质粒pTriEx-N鉴定

2.3.4重组质粒pTriEx-N测序结果

2.3.5 IHNV-N蛋白的原核表达

2.3.6 IHNV-N蛋白在杆状病毒表达系统的表达分析

2.4 讨论

第三章 IPNV-VP2蛋白的表达和纯化

3.1 材料与试剂

3.2 方法

3.2.1 引物设计

3.2.2 IPNV-VP2基因的合成

3.2.3重组质粒的构建

3.2.4 IPNV-VP2蛋白的原核表达与纯化

3.3 结果与分析

3.3.1 IPNV-VP2基因的PCR扩增结果

3.3.2 重组质粒pTriEx-VP2的酶切鉴定

3.3.3 IPNV-VP2蛋白在大肠杆菌中的表达分析

3.3.4 IPNV-VP2蛋白的分离纯化

3.4 讨论

第四章 IHNV-N和IPNV-VP2抗血清制备及检测

4.1 材料与试剂

4.1.1 实验动物

4.1.2 实验试剂

4.1.3 主要溶液配方

4.1.4 主要使用仪器

4.2 实验方法

4.2.1 免疫兔子制备抗血清

4.2.2Dot blot检测免疫效果

4.2.3 间接ELISA检测抗血清效价

4.3 结果与分析

4.3.1Dot blot检测免疫效果

4.3.2间接ELISA检测抗血清效价

4.3.3抗血清检测病鱼样本

4.3.4抗血清交叉性反应检测

4.4 讨论

第五章 全文总结

参考文献

附录

附录1 主要试剂

附录2 pTriEx-N质粒图谱

附录3 pTriEx-VP2质粒图谱

附录4 主要使用仪器

致谢

个人简历