立氏立克次体主要表面蛋白鉴定及其免疫保护性研究

摘要

立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)是一种严格胞内寄生的革兰氏阴性菌，为落基山斑点热(Rocky Mountain Spotted Fever, RMSF)的病原体。RMSF在自然界主要通过蜱叮咬而传播，在人为情况下可以通过气溶胶传播。RMSF临床表现主要是急性发热、头疼、肌肉酸痛和皮疹，如果治疗不及时出现急性肺水肿、肾衰竭、脑炎等严重症状而死亡。疫苗的免疫接种是预防人立氏立克次体自然感染和人为感染的最有效手段。
　　目前，灭活立氏立克次体疫苗的免疫保护效果不理想。立氏立克次体作为一种专性胞内寄生菌，其表面蛋白能够介导立克次体入侵血管内皮细胞（宿主细胞）、宿主细胞间迁移、宿主免疫系统激活等，在立克次体感染的发生、发展中扮演着重要的角色。因此，鉴定立氏立克次体保护性表面蛋白抗原并用其构建亚单位疫苗是近几十年来RMSF疫苗的主要发展方向。本研究通过蛋白质组学方法分离鉴定立氏立克次体主要的细胞表面蛋白，通过动物免疫保护实验筛选保护性表面蛋白抗原，通过体液免疫和细胞免疫分析探讨保护性抗原的免疫保护机制。
　　首先，采用生物素标记立氏立克次体表面蛋白，通过链亲和素亲和层析和双向电泳分离出己标记的细胞表面蛋白，随后用电喷雾串联质谱对这些表面蛋白进行鉴定。结果共鉴定出10个主要表面蛋白，其中5个蛋白(OmpA、OmpB、 GroEL、GroES、DNA-bing protein)已有报道，另外5个蛋白(Adr1、Adr2、OmpW、Porin_4、TolC)为新鉴定的立氏立克次体细胞表面蛋白。生物信息学分析发现，5个新表面蛋白均含有β折叠和信号肽，为多次跨膜蛋白;间接免疫荧光和透射免疫电镜进一步证实5种新表面蛋白可存在于细胞内膜和/或外膜。将5个新表面蛋白基因克隆和原核表达，研制出5个重组蛋白(rAdrl、rAdr2、rOmpW、rPorin_4、rTolC)。用这5个重组蛋白分别免疫小鼠制备免疫血清，血清中和实验揭示rAdr1、rAdr2、rOmpW免疫血清能够显著地抑制立克次体入侵宿主细胞，提示这3个蛋白均能够诱导机体产生高水平中和抗体。将5个重组蛋白分别免疫小鼠，用立氏立克次体毒株攻击后显示rAdr1、rAdr2、rOmpW、rPorin_4等重组蛋白免疫小鼠的肺脏立克次体载量和病理损伤显著地低于和轻于非免疫小鼠，特别是rAdr2免疫小鼠的肝脏、脾脏和肺脏中立克次体的载量都明显地低于非免疫小鼠，证明Adr1、Adr2、OmpW和Porin_4是立氏立克次体的保护性抗原，特别是Adr2是一个重要保护性抗原。
　　在前期黑龙江立克次体的研究中发现重组蛋白rYbgF具有很好的免疫保护性，蛋白序列比对显示立氏立克次体和黑龙江立克次体的YbgF蛋白245个氨基酸序列中仅有6个氨基酸的差异，提示该蛋白为斑点热群立克次体的保守抗原。透射免疫电镜观察确认YbgF蛋白在立氏立克次体外膜和内膜上呈多点分布。血清学中和试验证明rYbgF免疫血清能够显著抑制立克次体对血管内皮细胞的入侵，提示YbgF在介导立克次体入侵血管内皮细胞过程中起重要作用。此外，小鼠免疫保护实验发现rYbgF免疫组小鼠的肝脏、脾脏和肺脏中立克次体的载量及病理学损伤程度明显地低于和轻于非免疫小鼠，证明YbgF也是立氏立克次体的重要保护性抗原。
　　为了进一步阐明rAdr2和rYbgF的免疫保护机理，将其分别免疫小鼠，用ELISA检测首次免疫后第14、28、42、56天血清IgG、IgG1和IgG2a的效价变化，结果发现两者均能诱导小鼠产生高水平特异性IgG、IgG1和IgG2a，特别是IgG2a与IgG1的比值随免疫时相而逐渐上升，说明两者均能诱导小鼠产生特异性IgG2a为主的Th1型体液免疫反应。在体外用rAdr2、rYbgF分别刺激立氏立克次体感染小鼠的CD4+和CD8+T淋巴细胞，结果发现rAdr2和rYbgF均能诱导立克次体抗原致敏的CD4+和CD8+T细胞显著增殖并分泌高水平的IFN-γ和TNF-α，证明rAdr2和rYbgF均能够有效诱导Th1型细胞免疫应答。
　　许多研究已经证明OmpB为立克次体的主要保护性抗原。本研究根据基因编码蛋白抗原性和亲水性等将立氏立克次体完整的ompB基因(4965bp)分成5个片段并在大肠埃希菌细胞内分别表达，制备5个重组蛋白(rOmpB-1～rOmpB-5)。免疫保护实验显示这5个重组蛋白均能诱导小鼠对抗立氏立克次体感染，其中rOmpB-4的免疫保护效果最好。将rOmpB-4与rAdr2联合免疫小鼠，发现联合免疫小鼠的免疫保护效能显著好于rAdr2和rOmpB-4的单独免疫。进一步研究发现rOmpB-4与rAdr2联合疫苗能够诱导小鼠产生显著增强的Th1型特异性免疫应答，即抗原特异性T细胞产生更高水平IFN-γ和TNF-α及B细胞产生更高水平特异性IgG2a。
　　贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）是一种隶属于军团菌目、类似于立克次体的胞内寄生茵，为Q热的病原体，与立氏立克次体一同被列入生物战剂。先前的研究表明贝氏柯克斯体氯仿甲醇提取残留物（chloroform-methanol residue of C.burnetii，CMR-C）是一种潜在的免疫增强剂。本研究将CMR-C与立氏立克次体rOmpB-4混合免疫小鼠，立氏立克次体攻毒结果显示混合免疫小鼠脏器中立氏立克次体的载量显著低于rOmpB-4单独免疫小鼠，证明CMR-C能够显著增强rOmpB-4特异性免疫保护效能。另外，用贝氏柯克斯体攻击联合免疫小鼠，发现小鼠脾脏柯克斯体载量显著低于rOmpB-4单独免疫小鼠，证明该联合免疫具有抗立氏立克次体和贝氏柯克斯体的双重免疫保护效能。进一步研究发现该联合免疫小鼠能够产生高水平的抗细胞内寄生菌关键细胞因子IFN-γ和TNF-α。
　　综上所述，本研究共发现了立氏立克次体5个新的细胞表面蛋白(Adr1、Adr2、OmpW、Porin_4、TolC)，其定位于立克次体外膜和/或内膜;研究还证明Adr2和YbgF为立氏立克次体主要保护性抗原，另外证明立氏立克次体外膜蛋白B片段rOmpB-4与rAdr2联合免疫的特异性保护效能显著强于其单独免疫，以及CMR-C能够显著增强rAdr2的特异性免疫保护效能。进一步研究发现这些有效和增强的特异性免疫保护主要依赖于它们诱导产生的Th1特异性免疫应答，包括激活抗原特异性CD4+和CD8+T淋巴细胞产生和分泌高水平IFN-γ和TNF-α，以及激活B淋巴细胞产生分泌高水平特异性IgG2a。在这些特异性免疫因子的协同作用下，机体能有效或更有效地杀伤和清除血管内皮细胞内寄生的立氏立克次体。本研究为落基山斑点热亚单位疫苗的研发提供新的候选抗原分子，同时也为研究立氏立克次体致病机制揭示了潜在致病分子。另外，CMR-C与rOmpB-4联合免疫为研发抗立氏立克次体和抗贝氏柯克斯体感染的双效疫苗提供一种新的思路。

目录

声明

缩略词表

摘要

前言

1、立氏立克次体的主要生物学特性

2、立氏立克次体的致病机制

3、落基山斑点热疫苗研究现状

4、本课题的研究目的及意义

第一部分 立氏立克次体表面蛋白的分离与鉴定

引言

1 材料

1．1 实验动物、菌株及鸡胚

1．2 主要试剂

1．3 实验仪器

1．4 主要试剂的配制

2 方法

2．1 复苏立氏立克次体毒株并感染Vero细胞

2．2 Gimenez染色法和间接免疫荧光法(IFA)观察立克次体

2．3 空斑法获取立氏立克次体单克隆菌株

2．4 立氏立克次体单克隆株的鉴定

2．5 立氏立克次体单克隆株的大量培养及纯化

2．6 生物素亲和层析分离立氏立克次体表面蛋白

2．7 双向电泳和质谱分析

2．8 生物信息学分析各外膜蛋白的结构及功能

2．9 表面蛋白在立氏立克次体的定位

3 结果

3．1 立氏立克次体复苏

3．2 立氏立克次体克隆与鉴定

3．3 立克次体的培养及泛影葡胺不连续密度梯度离心纯化

3．4 双向电泳及质谱鉴定立氏立克次体表面蛋白

3．5 生物信息学分析

3．6 立氏立克次体表面蛋白的亚细胞定位

4 讨论

第二部分 立氏立克次体表面蛋白免疫保护性及其机制研究

引言

1 材料

1．1 实验动物、菌株、细胞、质粒

1．2 主要试剂

1．3 实验仪器

1．4 主要试剂的配制

2 方法

2．1 重组质粒的构建

2．2 重组蛋白的表达

2．3 立氏立克次体重组蛋白抗原的免疫印迹分析

2．4 血清中和试验

2．5 动物保护性试验一：五种新发现细胞表面蛋白免疫保护性评价

2．6 动物保护性试验二：重组蛋白Adr2和YbgF免疫保护性评价

2．7 T细胞增殖及相关细胞因子检测

2．8 间接免疫荧光和透射免疫电镜研究YbgF蛋白亚细胞定位

2．9 统计学分析

3 结果

3．1 立氏立克次体重组蛋白的免疫印迹

3．2 YbgF蛋白在立氏立克次体表面的亚细胞定位

3．3 血清中和实验

3．4 免疫保护性评价

3．5 组织病理学分析

3．6 体液免疫

3．7 细胞免疫

4 讨论

第三部分 立氏立克次体保护性抗原免疫保护效力的增强研究

引言

1 材料

1．1 实验动物、菌株、细胞、质粒

1．2 主要试剂、仪器

2 方法

2．1 蛋白表达及纯化

2．2 小鼠免疫及攻毒

2．3 病理学切片的制备

2．4 特异性抗体的检测

2．5 IFA

2．6 血清中和试验

2．7 体外细胞因子检测

2．8 血清中细胞因子检测

2．9 统计学分析

3 结果

3．1 五个OmpB重组蛋白的免疫保护性评价

3．2 rAdr2与rOmpB-4联合免疫的保护效能评价

3．3 rAdr2与rOmpB-4联合免疫小鼠的组织病理学分析

3．4 rOmpB-4与CMR-C联合免疫的抗立氏立克次体保护效能评价

3．5 rOmpB-4与CMR-C联合免疫的抗贝氏柯克斯体保护效能评价

3．6 rOmpB-4与CMR-C联合免疫小鼠的组织病理学分析

3．7 血清中和试验

3．8 体液免疫反应

3．9 细胞免疫反应

4 讨论

结论

参考文献

附录

斑点热疫苗研究进展

代表性著作

个人简历

致谢