胰岛素促泌剂对大鼠胰岛素瘤细胞INS-1凋亡的影响

摘要

目的：糖尿病是目前人类继心血管疾病和癌症之后的第三大死亡因素，它以进行性的胰岛β细胞功能衰竭和胰岛素分泌缺乏为特点，胰岛β细胞凋亡在1型糖尿病中主要由自身免疫反应介导，在2型糖尿病的情况并不十分明确，近年来研究发现，2型糖尿病患者胰岛β细胞凋亡明显增加，二者之间的关系及2型糖尿病胰岛β细胞凋亡的机制逐渐成为人们关注的热点。目前临床上常规应用的口服降糖药为胰岛素促泌剂，它包括磺脲类（SUs）和非磺脲类促泌剂共10余种药物。但随着应用时间的延长，口服降糖药的疗效逐渐减弱，每年有5％～10％的患者发生SUs继发性失效，但其具体机制尚不清楚。本课题用5种胰岛素促泌剂干预体外培养的大鼠胰岛素瘤细胞INS-1,并通过各种实验室检测方法检测其凋亡情况，从整体上研究胰岛素促泌剂对胰岛β细胞凋亡的影响，探讨2型糖尿病患者胰岛p细胞凋亡的机制，对深入认识糖尿病的发病机制和致病过程，更合理地选择治疗糖尿病的药物，以减少口服药物失效的现象，缓解胰岛β细胞的凋亡，提高2型糖尿病患者的生存质量具有重要意义。并为2型糖尿病的合理治疗提供依据及新思路。
　　 方法：预实验培养试验用大鼠胰岛素瘤细胞INS-1,同时配制不同浓度的药物，观察药物对细胞的影响，通过MTT实验筛选确定实验所用的药物浓度，开始实验。培养的大鼠胰岛素瘤细胞INS-1生长状态良好时进行药物干预，试验分7组，分别选用临床上常用的5种胰岛素促泌剂（1组：格列苯脲；2组：格列吡嗪；3组：格列齐特；4组：格列美脲；5组：瑞格列奈；6组：阴性对照组；7组：溶剂对照组）干预细胞，每组又根据药物应用的不同浓度（高浓度、中浓度、低浓度）分为不同的亚组，每个亚组设六个样本，各浓度药物分别干预4h、24h、48h、96h后用不同的方法检测细胞活性及凋亡情况，倒置显微镜下观察各组细胞的生长状况→台盼兰染色、MTT法观察检测细胞的存活情况→胰岛素放射免疫试验检测细胞活力→DNAladder检测凋亡特异性DNA片段→TUNEL（原位末端核苷酸标记法）检测细胞凋亡率。
　　 所有数据均以均数±标准差（X±SD）表示，采用SPSS13.0统计软件进行分析，组内均数比较采用方差齐性检验与单因素方差分析（one-wayANOVA），各组间的两两比较用最小显著差法（theleastsignificantdifference，LSD）分析，检验水准α=0.05，P<0.05有统计学意义。
　　 结果：
　　 1、细胞形态学的比较：INS-1细胞正常生长时呈不规则的多边形、多角形，细胞间连接融合，胞浆内可见颗粒。格列本脲浓度为0.1umol/L，孵育4h后即可见到细胞胞质回缩，细胞间的连接明显减少，随着药物浓度增加、作用时间的延长，可见细胞变圆及出胞现象，还可见到凋亡小体，部分细胞脱落漂浮。格列吡嗪、格列奇特、格列美脲浓度为0.1umol/L，孵育4h后细胞变化不明显，增加浓度或延长作用时间也可见细胞胞质回缩，出胞、凋亡小体出现、细胞脱落。瑞格列奈浓度为0.01umol/L，作用48h，及0.1umol/L，作用24h细胞无明显形态学变化，再增加药物浓度及作用时间亦可见细胞胞质回缩，变圆，出胞、凋亡小体出现、细胞脱落。
　　 2、细胞MTT检测结果的比较：MTT检测法显示，细胞的存活率与药物呈现时间和剂量依赖性关系，与阴性对照组相比，空白对照组对细胞存活率的影响差异无显著性（P>0.05），格列本脲、格列吡嗪、格列奇特、格列美脲（低浓度）作用于INS-1细胞4h即可使细胞存活率明显下降（P<0.05），随着药物作用时间的延长和浓度的增加，细胞的存活率逐渐降低，组内比较差异有显著性（P<0.05），各组的组间比较差异无显著性（P>0.05），瑞格列奈（低浓度）作用于INS-1细胞4h对细胞存活率无显著影响（P>0.05），瑞格列奈（低浓度）作用于INS-1细胞24h甚至可以使细胞存活率增加，但无统计学意义（P>0.05），但继续延长药物作用时间的及增加药物浓度，细胞的存活率逐渐降低，组内比较差异有显著性（P<0.05），组间比较瑞格列奈与磺脲类药物相比，差异亦有显著性（P<0.05）。
　　 3、各组细胞DNALadder检测结果的比较：DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示，阴性对照组及空白对照组细胞的DNA条带无梯形条带出现，低浓度和中浓度格列本脲、格列吡嗪、格列齐特、格列美脲和瑞格列奈作用于细胞24h、48h后DNA条带无梯形条带出现，高浓度胰岛素促泌剂作用于细胞48h及中浓度胰岛素促泌剂作用于细胞96h后DNA梯形条带仍不明显，高浓度胰岛素促泌剂作用于细胞96h后的细胞DNA电泳条带呈现为明显的梯形条带。
　　 4、各组细胞凋亡率的比较：与阴性对照组相比，溶剂对照组对细胞凋亡无影响（P>0.05），各药物组凋亡率明显增高，药物干预4h，格列本脲（0.1umol/L、1umol/L、10umol/L）、格列吡嗪（0.1umol/L、1umol/L、10umol/L）、格列齐特（1umol/L、10umol/L、100umol/L）、格列美脲（1umol/L、10umol/L）分别使细胞凋亡率增加了2.21、2.5、2.71、1.9、2.1、2.2、1.7、2、2.6、2、2.57倍（P<0.05），格列美脲（0.1umol/L）及瑞格列奈对细胞凋亡率无影响（P>0.05），与以上几组组间比较差异有统计学意义（P<0.05）；药物干预24h，格列本脲（0.1umol/L、1umol/L、10umol/L）、格列吡嗪（0.1umol/L、1umol/L、10umol/L）、格列齐特（1umol/L、10umol/L、100umol/L）、格列美脲（0.1umol/L、1umol/L、10umol/L）、瑞格列奈（0.1umol/L、1umol/L）分别使细胞凋亡率增加了2.35、2.71、2.94、2.1、2.1、2.7、2.2、2.4、2.6、1.71、1.88、2.35、1.53、1.94倍（P<0.05），瑞格列奈（0.01umol/L）对细胞凋亡率无影响（P>0.05），与以上几组组间比较差异有统计学意义（P<0.05）；药物干预96h，格列本脲（0.1umol/L、1umol/L、10umol/L）、格列吡嗪（0.1umol/L、1umol/L、10umol/L）、格列齐特（1umol/L、10umol/L、100umol/L）、格列美脲（0.1umol/L、1umol/L、10umol/L）、瑞格列奈（0.01umol/L、0.1umol/L、1umol/L）分别使细胞凋亡率增加3.7、4.5、8.35、3.5、4.4、6.1、3.5、4.3、6.4、3.2、3.8、7、2.8、3.6、4.5倍（P<0.05）。组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
　　 5、各组细胞胰岛素释放功能的比较：不同浓度药物作用INS-1细胞后，与对照组比较，胰岛素促泌剂可以促进细胞分泌胰岛素，各组药物作用细胞4h对细胞胰岛素分泌无影响（P>0.05），但随着药物浓度增加、作用时间延长，各浓度组药物均可明显促进基础和高糖刺激后的胰岛素分泌，且呈浓度时间依赖性升高（P<0.05）；高糖组胰岛素分泌明显高于基础胰岛素分泌，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）；但随时间延长，各组胰岛素升高的幅度逐渐降低。
　　 结论：
　　 1、大鼠胰岛素瘤细胞INS-1具有良好的高糖刺激的胰岛素释放功能，可以作为有价值的模型用来研究胰岛细胞功能的很多方面。
　　 2、磺脲类药物可以促进胰岛β细胞凋亡，且细胞的致凋亡作用呈时间剂量依赖性增加。
　　 3、苯甲酸衍生物瑞格列奈对胰岛β细胞的凋亡影响较小，在小剂量短时间应用时还可以保护胰岛β功能。但是大剂量长时间应用也可以促进胰岛β细胞凋亡。

目录

文摘

英文文摘

研究生导师及课题指导小组成员简介

主要符号表

前言

材料与方法

一.材料

二.实验方法

结果

一.各组细胞形态学的比较

二.各组细胞MTT检测结果的比较

三.各组细胞DNA Ladder检测结果的比较

四.各组细胞凋亡率的比较

五.各组细胞胰岛素释放功能的比较

讨论

一、细胞的选取及培养

二、影响胰岛β细胞功能的因素

三、不同胰岛素促泌剂的作用特点

四、药物的浓度选择及制备

五、胰岛素促泌剂作用下细胞增殖率的变化

六、胰岛素促泌剂作用下细胞凋亡率的变化

七、各组细胞胰岛素释放功能的变化

结论

参考文献

综述:胰岛素促泌剂及其对胰岛β细胞功能的影响

参考文献

攻读学位期间取得的科研成果

致谢