新型5-羟色胺/去甲肾上腺素双重重摄取抑制剂ZBH2012001抗抑郁作用评价与机制研究

摘要

抑郁症(depress io n)是一种情感性精神疾病，以显著而持久的心境低落为主要特征。抑郁症临床症状主要有情绪低落、兴趣缺乏、睡眠障碍、精力减退、认知功能障碍和食欲下降等，严重者可出现自杀行为。世界卫生组织预计到2020年，在“全球疾病负担”排名中抑郁症将位居第二位。抑郁症由于其高发病率、高复发率、高致残率以及高自杀率正引起世界各国的高度重视。
　　现代对于抑郁症的治疗主要采用药物手段，临床上经典的抗抑郁药物多为靶向单胺系统设计，如单胺氧化酶抑制剂（monoamine oxidase inhibitors，MAOIs）、三环类抗抑郁药物（tricyclic antidepressants，TCAs）、5-羟色胺重摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs)、去甲重摄取抑制剂（norepinephrine reuptake inhibitors，NRIs）、及5-HT/NE双重重摄取抑制剂(serotonin and norepinephrine reuptake inhibitors，SNRIs)等，这类药物通过升高单胺递质含量改善抑郁病人的症状，如增强5-羟色胺（5-hydrozytryptamine，5-HT）或去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）含量。近些年来，多靶标抗抑郁药物的研发正成为研究热点方向，以度洛西汀、文拉法辛为主要代表的SNRIs类抗抑郁药物已成为临床一线用药。该类药物同时选择性增强5-HT和N E含量，起效快、抗抑郁活性强且不良反应少；同时该类药物临床用于多种神经病理性疼痛的治疗，对伴疼痛的重度抑郁症患者疗效更佳。然而，这些药物依然存在不足之处，如有效率低（仅60％-70%左右），起效时间延迟（服药后2-6周起效），不良反应多等，如度洛西汀由于可能造成肝脏毒性，美国FDA禁止其用于有肝损伤的病人。即使作用靶标相同，不同药物作用特点依然存在差异，因此，新型强效低毒的5-HT/N E双重重摄取抑制剂研发这对提高抑郁症患者生活质量，减轻社会负担仍具有重大意义。
　　前期以度洛西汀为先导化合物，军事医学科学院毒物药物研究所合成了一系列可能具有5-羟色胺/去甲肾上腺素（5-HT/NE）双重重摄取抑制作用的新型化合物，前期整体动物实验和体外初步靶标筛选发现ZBH2012001具有潜在抗抑郁活性，其结构新颖，具有自主知识产权，理论依据充分，作用机制可能与抑制N E和5-HT转运蛋白有关，该类药物代表了未来抗抑郁剂的研发方向，现有上市药物及在研药物中较少，因此本课题具有一定的创新性，有望解决现有抗抑郁剂起效延迟，有效率低，患者耐受等一系列瓶颈问题。本课题将分为四个部分系统评价ZBH2012001抗抑郁作用及其神经生物学机制，并结合药代动力学和急性毒性方面考察其成药可能性。
　　一、ZBH2012001靶标特性研究
　　采用放射性配体受体结合方法，在稳定转染人源性5-HT转运蛋白（ hSERT）和NE转运蛋白（hNET）的HEK-293细胞上评价ZBH2012001对两种单胺转运体的亲和力；采用钙离子内流法和cAMP试剂法检测ZBH2012001与5-HT1A、5-HT2 A、5-HT2 B、5-HT2 C、5-HT3、α1 A、α2 A、β2、D1、D2 S、H1、H2、M1、M2、OPRD、OPRM这16种G蛋白偶联受体或离子通道的亲和力。
　　结果显示，ZBH2012001与 hSERT和 hNET均有亲和力，Ki值分别为35.3±2.86 nM，224.5±26.0 nM，与SNRIs类临床一线用药度洛西汀相比，亲和力较弱，但均衡性与之类似，而与文拉法辛比较，亲和力均更强，且作用更均衡。而对包括5-HT1 A、5-HT2 A、5-HT2 B、5-HT2 C、5-HT3、α1 A、α2 A、β2、D1、D2 S、H1、H2、M1、M2、OPRD、OPRM在内的16种GPCR受体和离子通道均无激动或拮抗作用。结果提示，ZBH2012001是一种潜在抗抑郁药，其具有5-HT/NE双重重摄取抑制活性，并且靶标选择性良好。
　　二、ZBH2012001抗抑郁药理作用研究
　　采用小鼠行为绝望实验(包括悬尾实验和强迫游泳实验)、小鼠习得性无助模型、大鼠慢性不可预知应激模型，对ZBH2012001抗抑郁活性进行多模型综合评价。
　　结果显示，在小鼠行为绝望模型中，单次给予ZBH2012001（10～40 mg/k g， p.o.）显著降低小鼠悬尾不动时间和游泳不动时间；在小鼠习得性无助实验中， ZBH2012001（5～20 mg/k g，p.o.）显著逆转模型组动物逃避潜伏期的延长和逃避失败次数的增加；在大鼠慢性应激模型中，ZBH2012001（5～10 mg/k g，p.o.）显著逆转模型组动物爬格数和站立数的减少、蔗糖偏嗜度的降低、新奇环境摄食潜伏期的延长和强迫游泳不动时间的增加。结果提示，在多个抑郁动物模型上， ZBH2012001急、慢性给药均具有良好的抗抑郁活性，且在行为绝望动物模型中ZBH2012001与临床一线用药度洛西汀和文拉法辛相比，抗抑郁活性更强，提示其药效作用更强。
　　三、ZBH2012001抗抑郁作用机制研究
　　评价 ZBH2012001对单胺系统功能的影响，采用包括5-羟色氨酸(5-hydroxytryptophan，5-HTP)诱导小鼠甩头行为实验、育亨宾毒性增强实验、和小鼠利血平耗竭实验在内的药物诱导模型，并且采用高效液相色谱-电化学检测技术，检测ZBH2012001对利血平耗竭实验小鼠不同脑区单胺类神经递质及代谢产物含量的影响；评价ZBH2012001对于下丘脑-垂体-肾上腺素（hypothalamic pituitary adrenal，HPA）轴功能的影响采用酶联免疫法检测ZBH2012001对慢性应激大鼠血清皮质酮（ corticosterone， CORT）和促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）水平的影响，并且同时采用蛋白免疫印迹法检测ZBH2012001对慢性应激大鼠海马糖皮质激素受体(GRα/β)表达的影响；评价ZBH2012001对神经营养及神经可塑性的影响，采用蛋白免疫印迹分析技术，检测 ZBH2012001慢性给药对慢性应激模型大鼠脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）及其相关的MEK-ERK-CREB信号传导通路下调的影响；采用高尔基染色法，检测慢性给予ZBH2012001对慢性应激大鼠海马区神经锥体细胞神经元树突分支，树突棘密度的影响。
　　结果显示，单次给予 ZBH2012001(20～40 mg/k g，p.o.)可显著增加5-HTP诱导的小鼠的甩头行为次数、ZBH2012001(5～40 mg/k g，p.o.)可显著增强育亨宾毒性致死作用，ZBH2012001（10～20 mg/k g，p.o.）可显著逆转利血平耗竭单胺递质引起的小鼠眼睑下垂和体温降低，同时增加利血平耗竭模型小鼠脑组织海马的NE、5-HT水平，降低海马、前额皮层、纹状体、下丘脑5-HIAA/5-HT的代谢转化率；ZBH2012001（5～10 mg/k g，p.o.）能剂量依赖性逆转慢性应激导致大鼠HPA轴功能亢进，表现为血清CORT和ACTH升高、海马区GR表达减少；ZBH2012001（5～10 mg/kg，p.o.）能显著逆转慢性应激大鼠海马区BDNF、p-CREB和p-ERK蛋白表达的减少。ZBH2012001（5～10 mg/k g，p.o.）能显著逆转对慢性应激大鼠海马区神经锥体细胞神经元树突长度的缩短，分支和棘突密度的减少。结果提示，ZBH2012001能够提高脑内5-HT、N E含量，增强单胺神经传导能，抑制HPA轴功能亢进，增强神经营养功能和神经可塑性，这些可能是其抗抑郁作用的重要机制。
　　四、ZBH2012001的药代动力学及毒理学的初步评价
　　评价ZBH2012001的药代动力学特点，通过采用静脉或口服给予大鼠ZBH201200120 mg/k g，取大脑不同分区或分点采血，采用6460LC/MS/MS液相色谱/质谱联用仪测试样品中药物浓度，采用Phoenix WinNonlin软件(Certara Company， USA)计算非房室药代动力学参数（半衰期，达峰时间，峰浓度，生物利用度）；评价ZBH2012001的急性毒性反应，通过腹腔或口服给予小鼠不同剂量药物，观察小鼠死亡情况，计算LD50值。
　　结果显示，ZBH2012001静脉或口服后半衰期分别为2.3 h和1.9 h，达峰时间分别为0.0167 h和1.4 h，峰浓度分别为6886.8和815.1 ng/mL的生物利用度高， ZBH2012001的绝对生物利用度为60.5%，远高于度洛西汀和文拉法辛；ZBH2012001在小鼠的LD50口服为346.4 mg/kg，腹腔注射为132.3 mg/kg，高于度洛西汀和文拉法辛。结果提示ZBH2012001药代特性良好且具有一定的安全性。
　　综上所述，ZBH2012001作为潜在的5-HT/NE双重重摄取抑制剂，与SERT和 NET有温和亲和力，与 SNRIs类临床一线用药度洛西汀相比，亲和力较弱，但均衡性与之类似，而与文拉法辛比较，亲和力均更强，且作用更均衡。ZBH2012001对16种GPCR受体无激动或拮抗作用，提示其长期使用对心血管系统、胆碱能系统、组胺系统、阿片系统等带来不良反应的可能风险较低，安全性好。
　　ZBH2012001在多种抑郁动物模型上表现出明确的抗抑郁活性，与临床一线用药度洛西汀和文拉法辛相比，抗抑郁活性更强，提示其药效作用更强。其作用机制可能与增强5-HT和N E神经功能，抑制HPA轴功能亢进，增强神经营养功能、神经可塑性有关。ZBH2012001的药动学特性和初步毒性反应均较一线用药度洛西汀和文拉法辛好，提示ZBH2012001具有良好的成药性。

目录

声明

缩略词表

前言

1 抑郁症的定义及危害

2 抑郁症的发病机制

3 抗抑郁药物的研究进展

4 立题依据

第一章 ZBH2012001靶标特性研究

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第二章 ZBH2012001抗抑郁药理作用研究

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4.讨论

第三章 ZBH2012001抗抑郁作用机制研究

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第四章 ZBH2012001的药代动力学及毒理性的初步评价

1实验材料

2 仪器和检测条件

3 实验方法

4 实验结果

5 讨论

结论

参考文献

发表论文

个人简历

致谢