中国城市自然水环境中军团菌分布情况调查及嗜肺军团菌的遗传多态性研究

摘要

军团菌是革兰氏阴性杆菌，是军团菌病的病原菌。自1979年正式命名以来，军团菌属已发现58个种，70多个血清型，20多个种可以引起人类疾病，其中嗜肺军团菌引起的病例约占临床病例的90％。军团菌广泛分布于各种水环境中，包括江、河、湖泊、池塘、温泉、地下水等自然水环境和空调冷却塔、自来水、空气加湿器、人工喷泉等人工水环境。
　　由于军团菌病不能在人与人之间传播，只能由环境传播到人类，因此加强军团菌环境菌株的研究，对于军团菌病的溯源，研究临床菌株与环境菌株之间的关系等都有重要意义。目前对军团菌的研究主要集中于临床菌株和人工环境菌株，很少有研究关注自然水环境菌株。然而，对军团菌在其自然栖息地分布及遗传多态性的研究同样具有重要意义:首先，在我国缺少全国性的军团菌病监控系统，军团菌病的流行病资料非常匮乏，通过对自然水环境中的军团菌进行研究，可以了解自然水环境中军团菌的组成分布，对于预防和控制军团菌病的暴发流行有重要意义。其次，随着城市工业化进程的推进，自然水环境会越来越多地受到人类活动的影响，从而增加了自然水环境中军团菌作为潜在传染源的几率，了解自然水环境中军团菌的分布情况有助于军团菌病的预防和控制。第三，对自然水环境中嗜肺军团菌的种群结构及系统发育关系进行研究，有助于我们了解嗜肺军团菌的进化过程，为制定军团菌病的防治措施提供帮助。鉴于以上原因，我们在31个省、自治区、直辖市的31个城市的湖泊以及流经城市的主要江河等自然水环境中采集了水样，进行了军团菌的分离与鉴定。并对其中140株嗜肺军团菌进行了SBT分型，分析了其种群结构、系统发育关系及基因的重组，并与来自于人工环境中的菌株进行了比较。希望通过本研究，能够了解我国城市自然水环境中军团菌的组成及军团菌在各个城市中的分布，并对我国自然水环境中嗜肺军团菌的群体遗传学结构有一个初步了解，为我国城市中军团菌病的预防和控制提供有益信息。
　　2010年7月至2014年9月，在我国31个城市采集自然水样，每个城市选取5-8个采样点，每个采样点在不同的区域采集1-5份水样，共采集水样550份。采用离心浓缩(Centrifugation enrichment，CE)、膜过滤浓缩(Filtration enrichment，FE)和热富集浓缩(Heat enrichment，HE)三种方法对水样进行浓缩处理后，进行分离培养，疑似菌株通过mip基因测序和16S rRNA测序进行鉴定。经热富集浓缩后，550份水样中有171份分离出了军团菌，而离心浓缩和膜过滤浓缩处理的水样中，分别有74份和54份培养出了军团菌。热富集浓缩处理方法的培养阳性率显著高于离心浓缩和膜过滤浓缩处理水样的培养阳性率(31.1％ vs.13.1％，p＜0.001;31.1％ vs.9.8％，p＜0.001，卡方检验)。三种水样处理方法对四种军团菌（嗜肺军团菌、长滩军团菌、菲氏军团菌和吉斯特军团菌）的分离率产生了影响，且差异显著（Fisher精确检验，P＜0.05）。温度会对分离阳性率产生影响，经spearman相关性分析发现，分离阳性率与水样温度之间呈正相关(ρ=0.929，P=0.003)。
　　去除冗余菌株后，共获得404株军团菌，分属于23个军团菌种，其中嗜肺军团菌146株，占36.1％，是最常见的军团菌。在非嗜肺军团菌中，长滩军团菌、菲氏军团菌和戈尔曼军团菌最常见，分别占15.3％、12.6％和12.4％。在采集水样的31个城市中，29个城市的水样分离到了军团菌，嗜肺军团菌最常见，在25个城市的自然水环境中均有发现，长滩军团菌、菲氏军团菌和戈尔曼军团菌分别在21，22和20个城市的自然水环境中存在，且军团菌的种类在各个城市间的分布存在着差异。在239份阳性水标本中，75份同时存在两种以上（含两种）的不同军团菌，其中31份水标本存在三种以上（含三种）不同的军团菌，8份标本同时分离出了4种不同的军团菌。我们的结果显示在中国的自然水环境中，军团菌普遍存在且具有高度的多态性。
　　我们同时对其中的140株嗜肺军团菌进行了序列分型(sequence-based typing，SBT)。140株嗜肺军团菌可分为84个序列型(STs)，多样性指数(the index ofdiversity，IOD)为0.988(95％ CI:0.983-0.992)，84个序列型中有31个序列型与EWGLI的SBT数据库中已有序列型相同，53个为首次发现的新序列型，同时还发现11个新的等位基因。在84个序列T型中ST1417，ST1923和ST1968分别有6株嗜肺军团菌，ST1923和ST1968仅在海南发现，而ST1417的6株嗜肺军团菌分别分离自6个不同的城市。20个序列型包含两株以上的嗜肺军团菌，另外61个序列型仅含有1株嗜肺军团菌。
　　对140株嗜肺军团菌进行的种群结构分析发现了10个克隆复合体(clonalcomplexes，CCs)和47个singletons，其中CCI为中国自然水环境中的优势克隆复合体，包括分别属于10个序列型来自于9个城市的21株嗜肺军团菌，占所有菌株的15％，经过查询EWGLI的SBT数据库，CCI中10个序列型中有两个（ST239和ST1439）为致病序列型，提示CCI菌株可能会引起疾病。而中国人工环境中最常见的ST1-克隆复合体在自然水环境中并不是很常见，仅在5个城市分离的7株嗜肺军团菌属于该克隆复合体。另外，10株携带完整lag-1基因的菌株不在任何一个克隆复合体内，提示在自然水环境中，高致病力菌株并不占优势。在本研究的140株自然水环境嗜肺军团菌中，虽然未发现基因内重组事件，但发现了12个基因间重组事件:在所有的84个序列型中，74个序列型发生了基因间重组，而且其中有17个序列型发生了两次重组事件。
　　通过比较发现，不同环境与地区菌株在分子水平上的差异并不显著，但自然水环境菌株与人工水环境菌株之间却存在着显著的差异。
　　我们的结果显示在中国的自然水环境中，嗜肺军团菌具有高度的遗传多态性且重组频繁，不同环境及地区的自然水环境嗜肺军团菌在分子水平上差异并不显著，但与人工水环境中的菌株有显著差异。

目录

声明

摘要

缩略语

第一部分 引言

1．军团菌及军团菌病的历史与现状

2．水环境中的军团菌

3．军团菌的基因分型方法

4．嗜肺军团菌的群体遗传学结构

5．嗜肺军团菌环境分离株的遗传多态性

6．本研究的技术路线

7．本研究的目的和意义

第二部分 中国城市自然水环境中军团菌分布情况调查

1．前言

2．材料

2．1．培养基

2．2．酶与试剂

2．3．主要仪嚣

3．方法

3．1．主要培养基的配置

3．2．主要溶液的配置

3．3．采样城市

3．4．水样采集策略及水样采集

3．5．水源温度及pH值测定

3．6．水样的处理

3．7．军团菌的分离培养

3．8．DNA提取

3．9．mip基因测序

3．10．部分16S rRNA基因序列测定

3．11．数据分析

4．结果

4．1．水样采集

4．2．菌种分布

4．3．样品分离阳性率

4．4．军团菌在各个城市中的分布

4．5．同一样本中的不同种军团菌

5．讨论

6．小结

第三部分 中国城市自然水环境中嗜肺军团菌的遗传多态性

1．前言

2．材料

2．1．菌株

2．2．培养基

2．3．酶与试剂

2．4．主要仪器

2．5．相关软件

3．方法

3．1．血清分型

3．2．lag-1基因的扩增

3．3．SBT

3．4．群体遗传学分析

3．5．重组分析

3．6．统计分析

4．结果

4．1．血清型分布

4．2．嗜肺军团菌菌株中lag-1基因分布

4．3．SBT

4．4．自然水环境菌株的种群结构

4．5．系统发育关系

4．6．不同地区菌株分布

4．7．不同水环境中菌株分布

4．8．基因内及基因间重组

4．9．自然水环境菌株与人工水环境菌株的异同

5．讨论

6．小结

参考文献

附表

综述 嗜肺军团菌的基因序列分型

已发表论文

个人简历

致谢