Ⅰ.高纯α2-巨球蛋白的规模化制备及其重要生物学功能研究；Ⅱ.六种近交系小鼠动脉粥样硬化易感性差异分析及动脉粥

摘要

α2-巨球蛋白（α2-Macroglobulin，α2-M）是一种大分子糖蛋白，其主要存在于血浆中，属于巨球蛋白超家族的一员。α2-M是由4个相同的单体组成的同源四聚体，每个单体均含有五个功能区域，这决定了其特性及生物学功能。α2-M能够广泛的参与机体的生理及病理活动，其最基本的功能是作为广谱的蛋白酶抑制剂清除内源性及外源性蛋白酶。有研究表明α2-M具有一定抗辐射作用，在治疗放射性肺炎、膀胱炎及其他放射性皮肤黏膜溃疡时效果良好。α2-M还能够与一些重要的细胞因子结合并调节其生物活性。除此之外，α2-M还能够抑制肿瘤及参与凝血平衡并作为诊断或预测某些疾病的生物标记物。对于α2-M一些生物特性及制备工艺研究的深入将有助于推进α2-M在临床治疗的应用。
　　可用于制备α2-M的原料血浆是非常有限的，尤其是在发展中国家。当前血浆主要用于制备免疫球蛋白、白蛋白和凝血因子，直接以血浆为原料制备α2-M则并不现实。Cohn组分IV（Cohn Fraction IV，Cohn FIV）是基于乙醇沉淀的Cohn氏分离过程中一个副产物，但其中富含大量的α2-M。因此以Cohn FIV作为原料纯化制备α2-M能够起到综合利用血浆的目的。基于上述背景，本研究主要分为以下四个方面。
　　（1）α2-M实验室制备工艺的建立
　　α2-M的活性测定在纯化制备过程中是必不可少的质控指标。作为一种蛋白酶抑制剂，α2-M能够与蛋白酶相互作用形成“α2-M-蛋白酶复合物”。与其他蛋白酶抑制剂不同，α2-M并不会破坏蛋白酶的活性位点。因此与α2-M结合的蛋白酶并没有失活，而仅仅是由于空间屏障作用，失去了与大分子底物作用的机会。BAPNA是一种小分子底物，能够穿过空间屏障与蛋白酶的活性位点相互作用。通过检测410 nm吸光值可以从侧面考察与α2-M结合的蛋白酶量。在测活的反应体系中，胰蛋白酶、BAPNA、大豆胰蛋白酶抑制剂（Soybean Trypsin Inhibitor，SBTI）的量需要首先被确定。此外还需要建立α2-M标准曲线。通过这种发色底物的原理建立了α2-M活性测定方法。
　　关于从Cohn FIV纯化制备PC、Tf、AAT的研究已经有所报道。尽管α2-M在Cohn FIV中含量很大，但是并没有关于将其从Cohn FIV分离纯化的研究报道。之前关于α2-M纯化制备的研究主要是综合利用凝胶过滤、免疫吸附层析、Cibacron蓝色琼脂糖层析等方法。
　　本研究中通过二维电泳的方法初步考察了Cohn FIV的蛋白组成。尝试了盐析法、CaptoTM Core700层析介质、Aerosil380、PlanovaTM35N滤器在α2-M纯化方面的效果。由于α2-M是一个大分子的锌离子结合蛋白，因此我们采用了锌离子亲和层析、凝胶过滤的方法纯化α2-M。经过蓝色琼脂糖亲和层析后，最终获得了纯度98％的α2-M，工艺的活性回收率在48%左右。利用质谱的方法定性鉴定了终产品，考察了不同温度、pH、不同浓度甲胺对α2-M活性的影响，这为α2-M纯化及保存过程避免活性损失提供了帮助。实验结果显示在温度高于50℃、pH高于9.0、pH小于4.0及甲胺存在的条件下，α2-M的活性很容易损失。
　　（2）从Cohn FIV中规模化制备高纯α2-M
　　关于α2-M纯化制备的报道有很多，但是可能存在的一些问题会制约这些制备工艺的进一步应用。
　　1.几乎所有的纯化方法使用的纯化原料均为人血浆，但当前以血浆作为原料制备α2-M是不现实的。
　　2.有些纯化工艺不能同时取得高纯的α2-M及较高的回收率。免疫吸附虽然是一个很有效的方法，但是应用于工业生产的成本较高。
　　3.很少有关于α2-M大规模制备的工艺报道。虽然利凡诺法曾经被报道可用于α2-M规模化制备，但是20世纪90年代中国政府禁止了利凡诺用于人血液制品的制备。
　　4.很多报道的工艺要求血浆中Hp的类型为1-1型，而该Hp型人群的比例仅为14.5%。
　　本研究中的纯化工艺基于盐析法、锌离子亲和层析、超滤法，以 Cohn F IV为原料获得了高纯的α2-M。通过质谱分析及氨基酸组成分析证实，获得的终产品为α2-M。据我们所知，这应该是首先从Cohn FIV分离纯化α2-M的研究。从CohnFIV制备α2-M提高了血浆利用率，并且本方法无需要求血浆中Hp的类型。经过三批次规模化制备，获得了280瓶α2-M(40 mg/瓶)。终产品的纯度为94.9%，比活为26.7μg/mg，工艺平均收率为20.5%。根据三批次产品质量，初步建立了α2-M质量标准，纯度、比活等核心指标被重新设定。制备工艺中使用的锌离子亲和层析介质价格便宜、线性流速快、抗压，这有利于规模化生产。
　　（3）α2-M纯化制备工艺中病毒灭活方法的优化
　　之前关于使用不安全血浆来源的血浆蛋白制品感染 HIV、HBV、HCV等病毒的事件是有所报道的。即使现在病毒灭活/去除工艺已经极大提高了病毒安全性，使用人血来源的血液制品时仍然存在感染血源性病原体的风险。巴氏灭活、干热、电离辐射、S/D法、层析法等灭活/去除病毒的方法已经被报道用于血浆蛋白制品的制备工艺中。
　　本研究选取了不同理化性质的病毒，考察巴氏灭活、干热、电离辐射、S/D法、层析法在α2-M工艺中病毒灭活/去除的效果。优化了巴氏灭活、干热、电离辐射过程中的保护剂。实验结果显示无保护剂时巴氏灭活和干热法能够有效的灭活有囊膜病毒和无囊膜病毒。25 kGy剂量辐照能够将指示病毒完全灭活，但有将近40%α2-M活性受到损失。S/D法可以有效的灭活有囊膜病毒，层析法也能够一定程度当去除病毒。
　　血液制品病毒灭活要求工艺中至少有两种互补的病毒灭活方法。根据我们的研究结果，在今后的进一步应用中从巴氏灭活、干热法、S/D法中选择两种灭活方法是十分必要的。本研究为今后α2-M工业制备中病毒灭活方法的选择奠定基础。
　　（4）α2-M重要生物学功能的研究
　　有报道称α2-M对辐射引发的皮肤和粘膜溃疡、放射性肺炎、放射性膀胱炎、角膜炎和角膜溃疡治疗效果良好。鉴于上述研究基础，我们选择了α2-M作用受体较多的L-929细胞开展研究。考察了α2-M对辐射后L-929细胞增殖、活性氧产生和细胞凋亡的影响。将α2-M用于经受7.25、8.00 Gy照射后的小鼠，并考察小鼠存活和体重变化。此外我们研究了α2-M对红细胞保存的影响，检测了血常规、血气、晶体渗透压、游离血红蛋白等指标。
　　研究显示α2-M能够显著提高 L-929细胞的增殖、降低其活性氧产生及抑制细胞凋亡，这些结果能够一定程度的解释α2-M的抗辐射作用。然而经过α2-M治疗后，并没有对照射后小鼠的体重恢复、存活率带来积极作用。经过α2-M孵育后红细胞溶血情况比较严重，因此α2-M并没有表现出较好的红细胞保存作用，相关方面的研究正在进行中。
　　动脉粥样硬化是缺血性心脏病、中风、外周动脉疾病和慢性肾脏病等疾病的一个主要诱发因素。迄今缺血性心脏病和中风仍然是世界上引起死亡人数最多的两种疾病。过去三十年来，通过有效的预防、具有降脂效果的他汀类药物和血管成形术的治疗，动脉粥样硬化等冠状动脉心脏病的死亡率已经有所下降，但死于这种疾病人数仍然远超其他疾病。发展中国家动脉粥样硬化心血管疾病的发病率正在迅速增加，以至于每年花费在该病预防治疗方面的费用超过了癌症、慢性阻塞性肺病和糖尿病等其他一些主要引起死亡的疾病。
　　目前，对于动脉粥样硬化的治疗主要是结合药物和手术综合治疗。使用的药物主要是具有减轻高脂血症、降血压或预防血栓形成并发症效果的他汀类药物、烟酸、阿司匹林、β-受体阻断剂或血管紧张素转化酶抑制剂。血管成形术/支架术和冠状动脉搭桥手术也常结合药物治疗动脉粥样硬化。血管内支架置入以防止收缩性血管重塑已经成功地在一定程度上减少血管手术后再狭窄的发生率，但是手术后3至6个月内患者发生动脉晚期再狭窄的概率仍然高达30%至50%，且这些患者发生严重急性心血管事件的风险仍然非常高。
　　新生内膜增生是动脉粥样硬化和支架术后再狭窄的一个主要病理过程。一种可能的机制表明新生内膜来源于从中膜向内膜异常增殖和迁移的平滑肌细胞。受机械损伤后内皮发生变性并释放细胞因子，这些释放的细胞因子会激活平滑肌细胞并促进其增殖和迁移。血管成形术均会损伤内皮，但并非所有接受手术的患者都会发生血管再狭窄。因此，一些其它因素对手术后血管再狭窄的发生发挥重要作用。最近的一些研究指出血管狭窄可能受到遗传因素的影响。目前新生内膜病变的发生发展是否也受遗传因素的影响尚未在载脂蛋白 E敲除小鼠品系中开展研究。Rcn2是一种新的细胞因子表达调节因子，其是否为动脉粥样硬化易感基因也不得而知。氯化钾和性别对心脏性疾病的发生发展有一定影响，至于其对动脉粥样硬化的作用尚不得而知。基于上述背景，本研究分为以下三章。
　　（1）六种不同品系小鼠载脂蛋白E敲除后动脉粥样硬化易感性差异及机制研究
　　颈动脉的血管重塑是许多心血管疾病如动脉粥样硬化和高血压的重要病理过程。在颈总动脉分叉附近结扎后造成的颈总动脉重塑的模型常被用于血管重塑的研究。在本研究中，将这种动脉重塑模型应用于六种不同的近交系小鼠。在新生内膜形成，管腔面积增加及血管壁肥大等方面观察到了显著的差异。
　　除C3H外，其他5种品系小鼠的结扎侧颈总动脉呈现出正向重塑，与对侧管腔面积相比，B6、BAL SM F1、SWR、BALB、SMJ的结扎侧管腔分别增加171%、63%、38%、15%、12%。除C3H和BAL SM F1外，其他4种品系小鼠的结扎侧血管壁面积显著增加，与对侧血管壁面积相比B6、SWR、BALB、SMJ分别增加209%、170%、79%、68%。与其他品系小鼠相比 B6结扎侧血管壁面积的增加是显著的。对于B6、SWR、BAL SM F1、BALB小鼠来说，结扎侧血管壁中细胞数是显著多于对侧的。这表明细胞增多是血管壁面积扩大的一个主要因素。SWR和 B6小鼠在颈总动脉结扎后容易形成新生内膜病变，但BALB，SMJ和C3H小鼠不容易形成病变。
　　选用SWR小鼠生成的病变通过免疫染色的方法进行细胞成分分析。分别用抗-α-平滑肌肌动蛋白和MOMA-2抗体检测平滑肌细胞和巨噬细胞。新生内膜病变主要由存在于纤维帽附近的平滑肌细胞组成，但没有观察到巨噬细胞。由于病理过程中平滑肌细胞从静止的收缩型转变为合成型，而抗-α-平滑肌肌动蛋白抗体属于收缩平滑肌细胞的特异性抗体，因此大量的合成型平滑肌细胞并没有发生相应的抗原抗体反应。选择B6和C3H来源的平滑肌细胞来研究其增殖和迁移能力。研究显示C3H平滑肌细胞的生长、迁移能力显著弱于B6的平滑肌细胞。
　　（2）Rcn2作为动脉粥样硬化易感基因的鉴定
　　结扎左颈总动脉研究基因Rcn2在动脉粥样硬化的发病过程中的作用。Rcn2-/-小鼠是在B6 apoE-/-小鼠基础上再敲除基因Rcn2获得的。实验中采用B6 apoE-/-小鼠作为对照。在本研究中分别采用高脂饮食和正常饮食饲养动物。在正常饮食条件下，结扎颈总动脉后Rcn-/-小鼠血管中没有观察到新生内膜病变，但B6 apoE-/-小鼠血管中生成了较大的病变。在高脂饮食条件下，B6 apoE-/-和Rcn2-/-小鼠血管中都形成了巨大的新生内膜病变。B6 apoE-/-小鼠结扎侧血管壁面积相比对侧显著增加，而在Rcn2-/-结扎侧血管壁面积相比对侧是减少的。在两种饮食条件下，结扎后B6 apoE-/-小鼠的颈总动脉呈现正性重塑，其结扎侧血管腔面积大于对侧管腔面积。Rcn2-/-小鼠结扎动脉呈现负性重塑，其结扎侧管腔面积是减少的。两种饮食条件下，B6 apoE-/-和Rcn2-/-小鼠在管腔面积方面的差异均是显著的。
　　通过免疫组织化学染色分析B6 apoE-/-和Rcn2-/-小鼠新生内膜病变中的细胞组成。正常饮食组B6 apoE-/-小鼠的新生内膜病变主要由平滑肌细胞和少数灶性聚集的巨噬细胞组成。高脂饮食组在B6 apoE-/-小鼠的病变中观察到一些灶性聚集的巨噬细胞。但由于从收缩型转变成合成型，所使用的抗体检测不到合成型平滑肌细胞。高脂饮食组Rcn2-/-小鼠的新生内膜病变中充满巨噬细胞，这完全不同于B6 apoE-/-小鼠。源于Rcn2-/-小鼠的内皮细胞的迁移能力显著弱于来自B6 apoE-/-小鼠的内皮细胞。敲除Rcn2导致内皮细胞增殖较慢，但该结果没有统计学意义。
　　（3）氯化钾和性别对动脉粥样硬化发病过程的影响
　　性别和氯化钾被认为是心脏性疾病发展过程中的两个重要因素。我们之前观察到血浆中Rcn2浓度与氯化钾浓度呈明显的负相关。在本研究中，对雄性和雌性B6 apoE-/-小鼠进行颈动脉结扎，以研究不同性别之间动脉粥样硬化易感性的差异。本研究还评估了氯化钾对源自B6 apoE-/-和Rcn2-/-小鼠的内皮细胞的增殖和迁移的影响。
　　对比颈总动脉结扎后的雄性和雌性B6 apoE-/-小鼠，尽管两者在新生内膜病变、结扎侧与对侧血管壁面积差值、新生内膜与结扎侧血管壁面积比方面存在一定差异，但该差异没有统计学意义。雄性小鼠的左侧颈动脉呈现出正性重塑，结扎侧血管腔比对侧增加超过70%，而在雌性小鼠颈动脉呈现负性血管重塑。氯化钾对从B6 apoE-/-和Rcn2-/-主动脉分离的内皮细胞的增殖和迁移没有显著影响。可能是因为氯化钾对细胞的作用是一种慢性过程。

目录

声明

缩略词表(Abbreviation)

Ⅰ. 高纯α2-巨球蛋白的规模化制备及其重要生物学功能研究*

摘要

Abstract

前言

第一章α2-巨球蛋白实验室制备工艺的优化与建立

第二章α2-巨球蛋白规模化制备工艺的建立

第三章α2-巨球蛋白制备工艺中病毒灭活方法的优化与选择

第四章α2-巨球蛋白重要生物学功能的研究

结论

参考文献

Ⅱ.六种近交系小鼠动脉粥样硬化易感性差异分析及动脉粥样硬化易感基因Rcn2的鉴定*

摘要

Abstract

前言

第一章载脂蛋白E敲除的六种近交系小鼠动脉粥样硬化易感性差异及其机制研究

第二章Rcn2作为动脉粥样硬化易感基因的鉴定研究

第三章性别、氯化钾在动脉粥样硬化模型中对血管重塑及内皮细胞增殖、迁移影响

结论

参考文献

在学期间发表的代表性论著（全文）

个人简历

致谢