H-2半相合小鼠双供体造血干细胞移植模型的建立及相关研究

摘要

研究目的：建立一种新的单倍体造血干细胞移植模式，即H-2半相合小鼠双供体外周血造血干细胞移植模型。该新的移植模式可达到造血重建、供体长期完全稳定植入、GVHD程度轻、避免细菌、真菌及病毒等严重感染并发症、死亡率低的目的。
　　研究内容1、依据文献报道及本实验室成熟的实验方法，建立小鼠H-2半相合经典清髓性外周血造血干细胞移植模型，并鉴定该模型；2、在本实验室既往已经建立的实验动物模型的基础上，降低预处理强度，采用TBI2Gy预处理方案，输注等量的两种单倍体相合、单倍体相合联合完全不相合的供鼠G-CSF动员的外周血造血干细胞，并加大输注的细胞总量，建立H-2半相合小鼠双供体外周血造血干细胞移植模型，观察该模型的安全性和可行性，并与经典移植组相对照，比较造血重建规律、供体植入特点、GVHD发生率和GVHD致死率、生存率等情况；3、在此基础上，尝试在无预处理条件下，建立H-2半相合小鼠双供体外周血造血干细胞移植模型，并检测受鼠移植后各组织器官各细胞亚群中的供体植入率，以及外周血淋巴细胞亚群的变化等。
　　研究方法：经典清髓移植组：供鼠选择雄性C57，从移植前5天开始供鼠每天接受rhG-CSF（100μg/kg）的动员，皮下注射，间隔12h，2次/日，共5天之后提取脾单个核细胞（spMNC）。受鼠选择雌性CB6F1（雌性BALB/c和雄性C57的杂交一代），以8Gy TBI为预处理方案，TBI使用60Coγ射线，钴源距离为76cm，剂量率1.03Gy/min，受鼠经TBI照射2h之内回输经G-CSF动员的供体脾单个核细胞（spMNC)，细胞输注总量是3×107。移植后从小鼠一般状况、造血恢复、供体植入、GVHD发生情况、死亡情况、脏器病理等方面鉴定该模型；双供体移植组：受鼠也选择CB6F1，降低预处理强度至TBI2Gy（较经典移植降低了4倍）， TBI使用60Coγ射线，钴源距离为76cm，剂量率1.03Gy/min，受鼠经TBI照射2h之内回输经G-CSF动员的两种供体来源的spMNC共12×107（各6×107），移植物总细胞量是经典移植组的4倍。在保证雄性C57做半相合供者不变的前提下，为探讨另一个半相合供者BALB/c的性别以及第三方同种异基因全不相合供者C3H对植入的影响，我们将双供体移植组分为三组：A组=雄性C57+雌性BALB/c， B组=雄性C57+雄性BALB/c，C组=雄性C57+雄性C3H。观察双供体移植各组的造血重建、供体植入、GVHD发生情况及生存情况等。与经典移植组对比，证实双供体移植模型的可行性和安全性，并优化新的双供体单倍体移植模型；在此基础上，尝试在无预处理条件下，建立H-2半相合小鼠双供体移植模型，观察小鼠一般状况、造血、植入、GVHD、死亡、脏器病理等情况，并检测受鼠移植后各组织器官和各亚群中的供体嵌合率等。
　　研究结果：首先，本实验成功建立了小鼠H-2半相合清髓性外周血造血干细胞经典移植模型。其次，在上述实验动物模型的基础上，降低预处理强度（TBI由8Gy降低到2Gy），通过输注双供体造血干细胞，加大移植物细胞总量（由3×107增加到12×107），不使用免疫抑制剂，不做GVHD预防，成功建立了小鼠H-2半相合双供体外周血造血干细胞移植模型。
　　具体而言，经典移植组和双供体移植各组的而对比结果有：①经典移植组出现严重造血抑制，WBC<1×109/L持续3-5d；A、B、C各组未出现造血抑制（WBC3×109/L)；②经典移植组快速植入，1w达到外周血完全植入；A、B、C各组1w混合植入，2w达完全植入。③经典移植组移植后34天GVHD发生率及GVHD致死率均为100％。双供体移植组：34天总体GVHD发生率及致死率分别是49.6%、50%(P＜0.01, P＜0.05)，50天分别60.4%和81.2%，50天总体存活率50.9%。④双供体移植组中，两种供者在受鼠体内的供体植入率有差别。双供体移植A组和B组中， C57雄性供者在植入上占优势，2w之内受鼠体内可检测到少量雌性BALB/c供体成分，2w之后受鼠体内C57供者完全植入。而C组受鼠在早期（4d）时检测供体植入率即无C3H供体成分,2w时也可达到C57供者完全植入。⑤双供体移植A、B、C各组的造血恢复、供体植入率、GVHD发生率均无差异，B和C组GVHD致死率略少于A组，但无统计学意义(P＞0.05,P＞0.05)；B组OS略优于C组及A组，但无统计学意义(P＞0.05,P＞0.05)。
　　无预处理条件下，也成功建立了H-2半相合小鼠双供体外周血造血干细胞移植模型，受鼠外周血细胞三系缓慢降低，但可自行恢复，完全未发生造血抑制。外周血细胞亚群（除外CD8+、CD11b+细胞）短暂受抑制，但可逐渐恢复正常。不做GVHD预防，却未见临床GVHD发生，组织脏器病理切片显示双供体组脏器损伤程度明显轻于经典移植组。受鼠外周血、各组织器官、各细胞亚群移植后均经过1m时间的混合嵌合才转化为完全嵌合，且无预处理条件下，双供体移植组小鼠移植后获得的供体嵌合体为多系嵌合体。
　　研究结论：预处理强度和免疫抑制剂不再是供体植入的必备条件。①以2Gy的TBI为预处理方案，较经典移植预处理强度（TBI8Gy）降低了4倍，输注等量的两种半相合供鼠细胞，细胞总量是经典移植细胞量的4倍，移植后不使用免疫抑制剂，无GVHD防治措施，结果移植后无明显抑制、造血重建快、植入稳定、GVHD明显减轻、长期存活明显增加，成功建立了H-2半相合小鼠双供体外周血造血干细胞移植模型，与临床双份脐血移植类似，双供体移植模型最终只有优势供体植入；②在无预处理条件下，成功建立了小鼠H-2半相合双供体外周血造血干细胞移植模型：受鼠造血细胞及外周淋巴细胞亚群短暂抑制但可逐渐恢复正常、完全避开造血抑制、虽然不做GVHD预防却未见临床GVHD发生、织脏器病理切片显示双供体组脏器损伤程度明显轻于经典移植组，外周血、各组织器官、各细胞亚群均经过1m时间的混合嵌合，最终转化为完全嵌合，且为多系嵌合体。本研究为临床开展HLA半相合双供体造血干细胞移植提供动物实验依据。

目录

缩略词表

前言

第一部分 小鼠H-2半相合清髓性造血干细胞移植模型的建立及鉴定

材料与方法

实验结果

讨论

小结

第二部分 H-2半相合小鼠双供体造血干细胞移植模型的建立与探讨

材料和方法

实验结果

讨论

小结

第三部分 无预处理H-2半相合双供体移植模型的建立及移植后受鼠的免疫功能检测

材料方法

实验结果

讨论

小结

参考文献

论著：H-2半相合小鼠双供体造血干细胞移植模型的建立

个人简历

致谢