基于表面等离子体共振技术的包膜病毒进入抑制剂-生物膜相互作用机制研究

摘要

包膜病毒的进入抑制剂主要包括抗体类进入抑制剂和多肽类融合抑制剂，通常通过作用于病毒包膜糖蛋白阻断其进入细胞过程的不同阶段，从而达到抑制病毒的目的。人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（Type-1 human immunodeficiency virus，HIV-1）融合抑制剂是目前研究最为广泛深入的包膜病毒进入抑制剂之一，而2013年底西非埃博拉疫情影响广泛，使得埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）进入抑制剂成为近年来包膜病毒进入抑制剂研究的热点。HIV-1在感染过程中通过表面糖蛋白gp120亚基与靶细胞受体结合，然后gp41亚基经过一系列结构变化介导HIV-1与靶细胞融合。EBOV的进入机制与HIV-1略有不同，首先通过表面糖蛋白GP1亚基与靶细胞表面受体结合使病毒内化，之后GP2亚基通过与HIV-1的gp41亚基类似的过程介导EBOV与靶细胞膜融合。目前对于包膜病毒进入抑制剂的作用机制的研究大部分着眼于进入抑制剂与病毒包膜糖蛋白的相互作用，然而进入抑制剂与生物膜的相互作用方式对其药效同样至关重要。本课题选择多肽类HIV-1融合抑制剂，中和抗体类EBOV进入抑制剂和由EBOV的GP2亚基C肽序列衍生而来的融合抑制多肽作为研究对象，通过研究它们与生物膜的相互作用特点，在生物膜水平上阐明它们的精确作用机制，并进一步探讨该作用机制与药效的关系。
　　过去进行生物膜机理研究的方法通常为一些物理-化学方法，如荧光光谱或电化学分析等，然而这些方法存在一些缺点。本课题中我们使用基于表面等离子体共振（Surface plasmon resonance，SPR）技术的Biacore生物传感器研究包膜病毒进入抑制剂与生物膜的相互作用。SPR技术可以连续监测结合动力学过程，具有极高的灵敏度，样品不需要经过荧光标记，具有其它传统方法不具备的优点。有文献报道病毒包膜中饱和磷脂(DPPC)、胆固醇、鞘磷脂(SM)等刚性成分的含量明显高于宿主细胞膜，因此我们选用不饱和磷脂POPC模拟普通宿主细胞膜，选用DPPC、胆固醇和SM等刚性成分模拟病毒包膜，选用带正电荷的EPC和带负电荷的POPG考察静电作用力对包膜病毒进入抑制剂与生物膜相互作用的影响。在Biacore T200生物大分子相互作用仪的传感芯片HPA和L1上分别构建单层和双层生物膜模型，成功构建了基于SPR技术的包膜蛋白进入抑制剂－生物膜相互作用系统，克服了常规方法的局限性。
　　在第一章中，我们分别研究了最具代表性的多肽类HIV-1融合抑制剂西夫韦肽、恩夫韦肽和T1249与生物膜的相互作用。实验结果显示：西夫韦肽选择性结合DPPC（亲和力比POPC双层膜高32倍）和SM（亲和力比POPC双层膜高31倍）；T1249选择性结合富含DPPC的生物膜（亲和力比POPC双层膜高9.6倍）和SM（亲和力比POPC高7.7倍）；而恩夫韦肽不能选择性结合富含刚性成分的生物膜。另外，参与研究的三种多肽类融合抑制剂与生物膜的相互作用均为表面结合，不存在插入或成孔。三种多肽对EPC生物膜的亲和力并不比中性离子磷脂成分的生物膜高，说明在多肽与生物膜的相互作用中起主要作用的是疏水作用力而不是静电作用力。西夫韦肽和T1249比恩夫韦肽的抗病毒药效和药代动力学性质更好，可能是由于它们选择性结合类似病毒膜和宿主细胞膜脂筏区域成分的生物膜，而作为融合过程关键因素的糖蛋白和相关受体就分别位于病毒包膜和脂筏区域，因此我们推测富含刚性成分的生物膜作为催化剂先将抑制剂催化到膜表面，然后抑制剂再与膜表面蛋白作用，产生抑制效果。我们将这种富含刚性成分的膜定义为“融合抑制催化膜”，这种“融合抑制催化膜”有可能成为HIV-1融合抑制剂的新靶标。
　　EBOV具有与HIV-1类似的进入机制。针对2013年底在西非爆发的埃博拉疫情，目前还没有获批上市的特效药物。在第二章中我们研究了中和抗体类EBOV进入抑制剂和由EBOV C肽衍生而来的融合抑制多肽。首先研究了由军事医学科学院牵头研发的极具开发潜力的中和抗体类EBOV进入抑制剂MIL77与生物膜的相互作用。MIL77由三种人鼠嵌合单抗MIL77-1，MIL77-2和MIL77-3组成。研究结果显示：MIL77-1能够选择性结合DPPC（亲和力比POPC大2.9倍）、富含胆固醇的生物膜（亲和力比POPC大2倍）和POPG（亲和力比POPC大5.6倍）。MIL77-1的作用靶点是与融合功能直接相关的GP2亚基，而其对生物膜刚性成分的选择性使其能够靶向 GP2亚基所在的病毒包膜和相关受体所在的宿主细胞膜脂筏区域，对POPG的选择性使其能够通过静电作用力固定在生物膜上，从而使MIL77-1能够在融合位点富集，有利于发挥其抗病毒作用。MIL77-2和MIL77-3对细胞膜的刚性成分没有选择性。MIL77-2的作用靶点是GP1亚基，该亚基与病毒融合过程不直接相关；MIL77-3的作用靶点是分泌型糖蛋白 sGP，并不位于病毒包膜上，因此MIL77-2和MIL77-3的生物学功能可能不依赖对生物膜成分的选择性。MIL77的研发者最近发表的最新研究进展显示，新的抗体组合MIL77E仅需两种抗体蛋白MIL77-1和MIL77-3即可完全保护致死剂量感染的非人灵长类动物，提示MIL77-2对于MIL77发挥抗病毒效果并不是必需的。这一结果也进一步证实了MIL77和MIL77E的抗病毒疗效与其对生物膜成分的选择性密切相关，富含刚性成分的生物膜可以在融合抑制过程之前作为催化剂促进药物在作用位点富集，从而提高药物的疗效。
　　研究者参照HIV融合抑制剂的设计原理设计合成了由EBOV的C肽序列衍生而来的融合抑制多肽Ebo-only。研究结果显示，Ebo-only对细胞膜的刚性成分没有选择性。体外研究结果发现Ebo-only序列的抗EBOV活性非常弱，其原因可能是多肽Ebo-only很难穿过宿主细胞膜进入细胞内，也就无法直接结合到融合位点发挥其抑制融合的作用。研究者发现在Ebo-only的N端链接具有内化功能的Tat序列形成Tat-Ebo和链接胆固醇形成Chol-Ebo都可以大大增强多肽的抗EBOV活性。
　　通过研究Tat-Ebo与生物膜的相互作用发现，Tat-Ebo能够选择性结合富含刚性成分的单层生物膜模型。同时，Tat-Ebo与生物膜模型的结合量比Ebo-only大10-40倍。由于Tat序列带有强烈的正电荷，因此Tat-Ebo通过静电作用力与带负电荷的POPG双层生物膜结合的最高响应值Rmax超过20000 RU，是其它生物膜的数倍，说明Tat-Ebo与双层生物膜的大量结合主要是由静电作用力驱动的。Tat-Ebo可能的作用机制是首先通过以静电相互作用力为主的相互作用大量结合在生物膜表面，继而通过胞吞过程进入细胞内，发挥其C肽序列对于“融合抑制剂催化膜”选择性结合特点，在融合位点附近富集，增加了药物作用位点附近的药物浓度，进而与膜表面蛋白相互作用发挥融合抑制剂功能，从而增强了药效，改善了药代动力学性质。
　　研究Chol-Ebo与生物膜的相互作用发现，Chol-Ebo对细胞膜的刚性成分没有选择性。Chol-Ebo对双层生物膜模型的结合量比Tat-Ebo高一倍，且不易解离，可能是造成Chol-Ebo比Tat-Ebo抗病毒活性更高的一个原因。Chol-Ebo对POPG双层生物膜模型的结合量小于Tat-Ebo，说明静电作用力不是Chol-Ebo与生物膜的主要相互作用力。Chol-Ebo可能的作用机制是首先通过疏水作用力和静电相互作用力大量结合在生物膜表面，继而通过胞吞过程进入细胞内，与膜表面蛋白相互作用发挥融合抑制剂功能，增强了药效。对于在细胞内完成融合过程的EBOV，其融合抑制多肽穿膜进入细胞内部的能力可能是其发挥融合抑制作用的关键。
　　本研究应用基于SPR技术的包膜蛋白进入抑制剂-生物膜相互作用研究系统，全面研究了包膜病毒多肽/蛋白类进入抑制剂与生物膜的相互作用特征，在生物膜水平上阐明了包膜病毒多肽/蛋白类进入抑制剂的可能作用机制，验证了“融合抑制催化膜”可能作为该类药物作用靶点的假设，并探讨了在融合抑制多肽上链接Tat序列和胆固醇能够显著提高其药效的作用机制，为此类药物的开发提供了新的思路和理论支持。同时本研究构建的包膜蛋白进入抑制剂-生物膜相互作用研究系统也有望推动SPR技术发展为生物大分子-生物膜相互作用研究的常规手段。

目录

声明

缩略词表

前言

一、艾滋病及抗HIV-1药物

二、多肽类HIV-1融合抑制剂的研发现状及作用机制研究

三、埃博拉病毒病及抗EBOV药物

四、SPR技术用于蛋白/多肽与生物膜相互作用的研究

五、本课题的研究目的和意义

第一章 多肽类HIV融合抑制剂与生物膜相互作用机制研究

第一节 西夫韦肽与生物膜的相互作用

1.实验材料

2.实验方法与步骤

3.实验结果

4.结论

第二节 恩夫韦肽与生物膜的相互作用

1.实验材料

2.实验方法与步骤

3.实验结果

4.结论

第三节 T1249与生物膜的相互作用

1.实验材料

2.实验方法与步骤

3.实验结果

4.结论

第二章 EBOV进入抑制剂与生物膜相互作用机制研究

第一节 中和抗体类EBOV进入抑制剂MIL77与生物膜的相互作用

1.实验材料

2.实验方法与步骤

3.实验结果

4.结论

第二节 基于EBOV C肽的融合抑制多肽链接Tat和胆固醇对其与生物膜相互作用特点的影响

1.实验材料

2.实验方法与步骤

3.实验结果

4.结论

讨论

一、HIV-1融合抑制剂与生物膜相互作用特点

二、HIV-1融合抑制剂与生物膜相互作用机制及与药效的关系

三、EBOV中和抗体类进入抑制剂与生物膜相互作用特点

四、EBOV 中和抗体类进入抑制剂与生物膜的相互作用机制及与药效的关系

五、EBOV包膜糖蛋白GP2亚基C肽衍生物Ebo-only与生物膜的相互作

六、Tat-Ebo与生物膜的相互作用机制及与药效的关系

七、Chol-Ebo与生物膜的相互作用机制及与药效的关系

八、包膜病毒进入抑制剂的作用机制

九、展望

结论

参考文献

附：已发表学术论文全文

个人简历

致谢