利用组织工程皮肤研究表皮干细胞在增生性瘢痕中的防治作用

摘要

增生性瘢痕是以胶原过度沉积为特征的一种病理现象，其诱发的具体机理目前仍不清楚。由于成纤维细胞是瘢痕形成的效应细胞，所以以往的研究都以此为重点。但是随着研究的不断深入，表皮细胞在瘢痕形成中的作用逐渐引起人们的关注。 早在1998年Warren等的实验结果就表明，正常表皮细胞的上清液对瘢痕成纤维细胞胶原分泌的抑制作用要远远强于瘢痕表皮细胞，并在一定的范围内具有浓度依赖性。2005年Belemare等采用组织工程皮肤模型检测表皮细胞对真皮组织的影响，其研究结果表明，与正常表皮细胞相比，瘢痕来源的表皮细胞可促使成纤维细胞产生更多的Ⅰ型胶原，导致更厚的真皮组织的形成，从而显示瘢痕来源的表皮细胞具有明显诱导真皮纤维化的能力。已经有越来越多的研究结果证明，异常的表皮—真皮相互作用关系在增生性瘢痕的发生中起着非常重要的作用。但是何种原因导致这种异常作用关系的出现，现在还不明确。 我们知道表皮的更新依靠表皮干细胞完成，它可以分化为表皮全层细胞，是表皮组织中最重要的细胞成分。表皮干细胞分布于真皮上方的基底层，是与真皮成纤维接触最密切的表皮细胞，它的存在是维持表皮—真皮正常作用关系的基础。研究表明，当皮肤受到严重外伤时，表皮干细胞进入一种“激活状态”，它们反复分裂、增殖，并发生异常分化，最终失去了原有的干细胞特性。对修复后的增生性瘢痕的研究也显示，瘢痕表皮的基底层薄，各种细胞器欠发达，功能低下，有别于正常表皮；瘢痕表皮细胞培养后与正常表皮细胞相比，细胞含量少，成活率低。由此我们推测，皮肤创伤的过度修复可能导致表皮组织中细胞成分的改变，尤其是一些重要的功能性细胞(例如表皮干细胞)的丧失，这些细胞成分的缺失或减少可能是导致表皮—真皮间异常的重要原因，是诱发瘢痕增生的因素之一。 本研究观察了增生性瘢痕中表皮干细胞分布、数量等的变化，并利用组织工程皮肤模型模拟体内环境，观察其对真皮成纤维细胞所产生的生物学效应，初步探索了具有干细胞性质的表皮细胞在瘢痕发生、发展中所起的作用，并为组织工程皮肤在瘢痕预防和治疗中的应用奠定了一定的实验基础。 本研究的主要内容和结果如下： 1.正常皮肤与瘢痕皮肤中表皮干细胞表达的差异 选取两种与表皮干细胞标志分子相对应的抗体(抗β1整合素抗体和抗CK19抗体)，应用免疫组织化学的方法，观察表皮干细胞在增生性瘢痕组织和正常皮肤组织中分布和数量的差异。 检测结果显示，在瘢痕皮肤中表皮层次异常，厚度增加，β1整合素和CK19的表达呈阴性或极微弱的表达；而正常皮肤中表皮较薄，细胞层次分明，β1整合素和CK19具有明确的强阳性表达，而且阳性细胞仅仅局限于基底层。说明瘢痕皮肤中表皮干细胞数目远远低于正常皮肤，甚至缺如。这一结果与临床上观察到的瘢痕皮肤再损伤后，表皮细胞增殖能力明显下降，愈合困难的现象相一致。 由此推断表皮干细胞或与之密切相关的细胞(例如，短暂扩充细胞)的缺失或减少可能是导致瘢痕皮肤中，表皮细胞对成纤维细胞分泌抑制作用减弱的重要因素之一。为了证明这一假设，进行了以下的实验。 2.富含表皮干细胞的组织工程皮肤的构建 取外科手术中废弃的包皮组织，分别进行表皮细胞和真皮成纤维细胞的原代培养，并进行相应的扩增。利用免疫磁珠分离技术获得以表皮干细胞为主的细胞群(β1整合素阳性)，通过免疫组织化学对分离的细胞进行鉴定，从而确定细胞分离的有效性。在不使用任何外源性支架材料的情况下完全依靠成纤维细胞自身分泌胞外基质形成真皮组织，然后将前述分离获得的表皮干细胞群种植其上，构建组织工程全层皮肤，观察此细胞群体在体外构建组织工程全层皮肤的能力，并分析将其用于增生性瘢痕研究的可行性。同时利用未经筛选的表皮细胞(即混合表皮细胞)构建组织工程皮肤作为对照。 结果显示，体外培养的皮肤成纤维细胞和表皮细胞状态良好。经过免疫磁珠筛选的表皮细胞99％以上为β1整合素表达阳性的细胞。将筛选后的表皮细胞用于组织工程全层皮肤的构建，HE染色结果表明，体外构建的组织工程皮肤均具有类似正常皮肤真皮和表皮的结构。在利用表皮干细胞群构建的组织工程皮肤中，表皮组织有明显的细胞层次，位于基底部的细胞呈规则的栅栏状排列；免疫荧光染色可见，其基底部位仍有β1整合素的表达，而且仅仅局限于基底层细胞，其余细胞各层则未见β1整合素的表达；透射电镜观察结果显示，位于此处的细胞连接紧密，多见桥粒形成。对照组表皮中细胞层次不明显，基底细胞排列不整齐，且该处细胞少见桥粒形成，免疫荧光染色未见表皮组织中有β1整合素的表达。 体外构建结果说明，应用表皮干细胞构建的组织工程皮肤更接近于正常皮肤的结构特征，如果将其用于增生性瘢痕的研究，可更有效地模拟正常皮肤中表皮-真皮的相互作用关系。 3.利用组织工程皮肤模型检测表皮干细胞对真皮纤维化及其相关因子的影响 应用透射电镜、RT-PCR和Westernblot等手段检测在组织工程皮肤模型中表皮干细胞对真皮的胞外基质形态、真皮纤维化的标志产物——Ⅰ型胶原分泌的影响，以及纤维化相关因子bFGF和TGF-β1表达水平的变化。 透射电镜观察显示，在应用表皮干细胞构建的组织工程皮肤的真皮组织中，成纤维细胞状态相对静止，胞膜少见分泌性小泡，细胞外的基质分布较为均匀，没有束状胶原或胶原密集排列现象出现。而在应用混合表皮细胞构建的组织工程皮肤的真皮组织中，成纤维细胞呈现出活跃的功能状态，胞膜多见分泌性小泡；在胞外基质中，分泌的胶原排列密集，有的区域甚至呈明显的束状排列；RT-PCR和Westernblot检测显示，表皮干细胞构建组中，Ⅰ胶原和TGF-β1无论在mRNA表达水平还是蛋白表达水平均低于混合细胞构建组，而bFGF的表达水平明显高于混合细胞组。 由此证明，表皮干细胞对真皮成纤维细胞的生物学行为有重要的影响，能够明显抑制真皮组织的纤维化；表皮干细胞所介导的bFGF、TGF-β1的表达水平的改变可能是其实现对真皮纤维化调节作用的途径之一。 4.利用动物模型检测表皮干细胞在瘢痕防治中的作用 制备兔耳全层皮肤缺损，应用富含表皮干细胞的组织工程皮肤，在体内环境下进一步确定表皮干细胞在增生性瘢痕中的防治作用。 组织工程皮肤修复2w后，混合细胞组肉眼观，创面结痂并有增生的肿块出现，已经上皮化的创面边缘略高于正常皮面；而表皮干细胞组创面已经完全上皮化，修复的皮肤没有肿块或硬结出现，创面平整。经组织切片、HE染色后显示，混合细胞组上皮化不完全，创面下有炎症细胞分布，并聚集有大量的成纤维细胞，纤维增生和毛细血管增生明显，有的区域可见胶原纤维漩涡状排列；而在表皮干细胞组中创面上皮化完全，修复的表皮组织细胞层次明显，略显过度增生状态，基底层细胞排列整齐，其下的真皮组织中未见或少见炎性细胞分布，成纤维细胞的分布与对照组相比较为分散。 动物实验结果说明，表皮干细胞的应用可以促进伤口的愈合，有效抑制兔耳创面增生性瘢痕的形成，从而进一步确定了表皮干细胞在瘢痕防治中的作用。 综上所述，本研究以检测增生性瘢痕皮肤中表皮干细胞分布及数量的异常为介入点，推测具有表皮干细胞性质的细胞成分的减少或缺失是引起真皮纤维化的重要因素，并应用组织工程方法分别在体外和体内证明这一推测的可靠性，从新的角度探讨了增生性瘢痕产生的机理。同时表明，表皮干细胞和组织工程皮肤构建技术的结合是非常具有前景的瘢痕防治手段。

目录

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缩略语

前言

综述(一)表皮干细胞与创伤愈合

综述(二)增生性瘢痕的研究进展

第一部分正常皮肤与瘢痕皮肤中表皮干细胞表达的差异

第二部分富含表皮干细胞的组织工程皮肤的构建

第三部分利用组织工程皮肤模型检测表皮干细胞对真皮纤维化的影响

第四部分利用动物模型检测表皮干细胞在瘢痕防治中的作用

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