痤疮丙酸杆菌活菌诱导单核细胞系THP—1细胞因子表达及反应氮中间产物系统杀伤作用的研究

摘要

本实验选用来源于人急性单核细胞性白血病的单核细胞系THP-1，研究单核细胞在被P.acnes活菌刺激后的早期天然免疫阶段，趋化性细胞因子IL-8，调节性细胞因子IL-10、IL-12，促炎细胞因子TNF-α和RNI系统中诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)、NO及自然抗性相关巨噬细胞蛋白1(naturalresistanceassociated-macrophageprotein1，Nramp1)表达量的变化，探讨天然免疫系统中单核-巨噬细胞细胞因子表达及反应氮中间产物(reactivenitrogenintermediate，RNI)系统杀伤作用的时相变化规律。 第一部分：痤疮丙酸杆菌活菌诱导THP-1细胞IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α的表达。 通过使用实时荧光定量PCR△Ct定量法，观察P.acnes活菌刺激人源性单核细胞系THP-1后不同时段细胞因子IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α的表达水平，探讨P.acnes活菌诱导THP-1表达细胞因子的时相规律。结果显示： 1.P.acnes活菌刺激后6hIL-8即达到高峰(P＜0.05)，到24h开始降低，72h后仍维持较高水平，说明与其他细菌感染一样，IL-8趋化大量中性粒细胞，参与天然免疫系统针对P.acnes感染的早期免疫应答，这与早期痤疮病理学特点中大量中性粒细胞聚集的表现相符合。 2.IL-10、IL-12表达量均在刺激后24-48h达到高峰(P＜0.05)，72h后开始逐渐下降，提示在IL-12升高的同时，作为对炎症反应的负调控，IL-10也开始表达，而且二者表达量变化的趋势一致，从而调节Th1/Th2平衡和NK、LAK细胞活性，在诱导炎症反应杀伤P.acnes的同时减少对机体的损伤。 3.TNF-α在刺激后6h到达高峰(P＜0.05)，48h后明显降低，提示单核细胞在P.acnes感染早期表达TNF-α，促进T细胞、B细胞的增殖，活化单核-巨噬细胞，提高中性粒细胞的吞噬能力，介导炎症反应。 上述结果说明，在针对P.acnes感染的天然免疫早期应答阶段，单核细胞即通过Toll样受体(TLRs)等模式识别受体识别P.acnes，表达IL-8、IL-12、TNF-α，进一步刺激单核-巨噬细胞、中性粒细胞、NK、LAK、CTL等免疫细胞分化增殖和相关促炎症细胞因子的表达，并且诱导、调节适应性免疫应答。这些细胞因子的表达，一方面杀伤P.acnes，另一方面也引起皮损局部血管扩张、血管通透性增加、各种炎症细胞聚集，从而产生炎症反应，皮损表现为红肿、丘疹及脓疱。同时，IL-10也开始对炎症反应进行负调控，控制炎症反应的程度，避免过度炎症反应造成的损伤。提示IL-8、IL-12p40、TNF-α是P.acnes感染后肉芽肿性病理表现形成的重要因素之一。 第二部分：痤疮丙酸杆菌活菌诱导THP-1细胞iNOS、NO及Nrampl的表达。 通过使用实时荧光定量PCR△Ct定量法，观察P.acnes活菌刺激人源性单核细胞系THP-1后不同时段iNOS、Nrampl的表达水平，通过Griess比色法检测培养液上清中NO的含量，探讨P.acnes活菌诱导THP-1产生活性氮中间产物相关因子的时相规律。结果显示： 1.iNOS表达量在刺激后6h即显著增加(P＜0.01)，维持到48小时开始降低，而NO浓度在刺激后6h即显著升高(P＜0.01)，到72h时仍维持较高水平，说明在P.acnes感染早期，单核—巨噬细胞系统就能作出反应，同时iNOSmRNA表达的高峰时段要比细胞培养液中NO含量高峰出现得早，而上清中NO浓度可在较高水平保持到72h，可能是因为iNOS的生物学活性可以维持96至120h，NO在培养液中积累所致。 2.Nrampl表达量在刺激后6h开始显著增加(P＜0.01)，维持到48h开始降低，说明Nrampl作为二价阳离子泵，在P.acnes感染瞬时免疫应答阶段即参与天然免疫过程，对RNI反应系统发挥辅助作用上述结果说明，天然免疫中的RNI反应系统在P.acnes感染的初期即参加免疫反应，Nrampl在RNI系统启动的同时也开始参与早期的天然免疫反应，可能意味着该系统可以抑制P.acnes产生抵抗NO杀伤的酶。 综上所述，在本实验中，应用实时荧光定量PCR△Ct定量法、Griess比色法，发现在P.acnes活菌刺激后，人源性单核细胞系THP-1在早期免疫应答阶段细胞因子IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α和RNI系统中iNOS、NO及Nrampl蛋白表达量显著增加。说明细胞因子IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α在单核-巨噬细胞系统的表达高峰主要在早期免疫应答阶段，96h后主要是由适应性免疫系统细胞产生，提示P.acnes能够通过这些细胞因子引起肉芽肿样改变。在针对P.acnes感染的早期免疫应答阶段，单核-巨噬细胞的RNI系统可以一直保持较高的非特异杀伤作用，为了抑制细菌产生抗RNI的酶类，二价阳离子通道蛋白Nrampl也同时表达，从而在由天然免疫到适应性免疫的过渡过程中，保持对细菌的杀伤抑制作用。促炎细胞因子及NO的产生对P.acnes起到杀伤抑制作用，但其对患者组织尤其是脑组织是否有损害，还需进一步探讨。以上实验结果首先明确了天然免疫对抗痤疮的机理，确定P.acnes能够诱导和产生肉芽肿有密切关系的细胞因子，为深入研究P.acnes相关的疾病的机理，也为进一步研究新疾病“外伤后细菌性致死性肉芽肿”中，脑组织和皮肤免疫细胞对P.acnes感染免疫应答差异等发病机理打下基础。

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