中国弹力纤维假黄瘤临床病理特征与ABCC6基因新致病性突变的研究

摘要

弹力纤维假黄瘤(PXE)是缘于ABCC6基因突变导致的常染色体隐性遗传病,该病人群中的发病率还未有明确统计,据估计约为1:70000~1:100000。PXE临床上可累及皮肤、眼底及心血管等多个系统,早期皮肤损害为颈部及身体皱襞部位的黄色丘疹,逐渐融合成松弛性斑块。眼部受累多由于Bruch’s膜的钙化形成血管样条纹,可以导致视力受损,甚至视力丧失。心血管受损源于动脉血管的矿化作用,包括动脉粥样硬化、下肢间歇性跛行、高血压等,有时会引起早期心肌梗死。此外,弹力纤维假黄瘤还能引起胃肠道出血,由于异常矿化作用使钙质沉积在不同的器官,包括肝、肾、脾、乳房、睾丸等。弹力纤维假黄瘤皮肤表现是类似的,病情预后取决于眼底及心血管等系统的并发症。皮肤和眼底的受累常常发生于青春期,也可发生于更早的幼年时期,心血管并发症常常出现较晚,多发生于成年期。
　　ABCC6基因位置在16号染色体1区上,包括31个外显子,编码1503个氨基酸构成跨膜转运蛋白,称为多药耐药相关蛋白即MRP6。这种跨膜蛋白主要表达在肝脏上,肾脏和肠道也有一定水平的表达,但PXE患者受累的皮肤、眼部及心血管系统则只能检测到很微量的表达。ABCC6基因的功能是作为一种有机阴离子输出泵,从肝脏到外周循环输送不确定的分子物质。近来研究通过建立敲除ABCC6基因的小鼠模型,已经证实PXE是一种代谢紊乱性疾病,但是从ABCC6基因突变到外周组织的矿化沉积具体的发病机制尚不清楚。超过90％的PXE患者被证实有ABCC6基因突变,截至目前已发现的ABCC6基因突变位点有800余个,包括第ABCC6基因翻译序列第1141位的一个无义突变和23-29区的大片缺失突变,这两个突变约占了所有发现突变的40%。
　　随着分子遗传学技术的迅速发展,外显子测序在医学研究领域的应用越来越广泛。大部分遗传性疾病的致病性突变集中于约1%的外显子区,这使得外显子测序成为研究孟德尔疾病即单基因遗传病的最简捷、最常用的方法。本研究我们收集来自国内9家医院的29例弹力纤维假黄瘤患者,分析其临床及病理特点,并通过外显子测序技术对其中22例样本合格的患者进行ABCC6基因突变位点检测,利用SIFT和PolyPhen-2致病软件预测突变的致病性,最终通过国际合作,利用小鼠模型和斑马鱼模型确定新发现的致病性突变。
　　目的：
　　1.分析中国PXE患者的临床与组织病理学特点;
　　2.检测中国PXE患者ABCC6基因的突变位点,明确新的致病性突变。
　　方法：
　　1.回顾性调查29例PXE患者的临床资料,并对其皮肤组织病理切片、弹力纤维染色、钙染色等进行综合观察分析;
　　2.利用PCR方法,用正常人作对照,观察每例患者有无文献报告中常见的23-29区大片缺失的突变;
　　3.通过外显子测序分析总结出22例PXE患者ABCC6基因突变位点;
　　4.利用SIFT prediction和PolyPhen-2 prediction两种软件预测所有发现突变位点的致病性;
　　5.利用小鼠模型,通过免疫荧光观察突变位点在小鼠肝细胞膜上或膜内的表达情况,验证突变位点的致病性;
　　6.构建转基因斑马鱼,根据突变载体能否纠正ABCC6基因缺失突变的斑马鱼情况,进一步明确突变位点的致病性。
　　结果：
　　1.29例PXE患者中,男女性别比例为1:8.7,平均发病年龄(22.6±11.2)岁;发病部位颈部占29例(100%),腋窝占11例(37.9%),腹部占5例(17.2%)、腹股沟占4例(13.8%);所有患者 HE染色都可发现真皮胶原卷曲样结构,弹力纤维染色可见到弹力纤维肿胀、断裂、卷曲、变性,钙染色可发现钙的沉积;5例患者做了眼底及心血管的检查,其中2例可见眼底血管条纹改变,较严重的1例发现眼底出血和视力受损,未发现心血管系统异常;
　　2.经PCR检测,所有患者均未发现23-29区大片缺失的突变;
　　3.新发现缺失或插入移码突变5个,即:C.4254 delG,C.30delG,C.196-197 inT,C.3586delC,C.196delT,这些突变造成氨基酸改变或编码终止,致病性明确;
　　4.利用SIFT prediction和PolyPhen-2 prediction两种软件预测出两类突变位点:1)软件预测的明确致病突变位点:①C.1814T>C(SIFT:Damaging0,PolyPhen-2:probably/1)②C.373G>A(SIFT:Damaging0.01,PolyPhen-2:probably/0.997)③C.11C>A(SIFT:Damaging0,PolyPhen-2:probably/0.957)④C.1256G>A(SIFT:Damaging0,PolyPhen-2:probably/0.994)⑤C.2843T>C（SIFT:Damaging0,PolyPhen-2:probably/0.988)⑥C.2126A>G(SIFT:Damaging0,PolyPhen-2:probably/0.916);2)软件预测的致病可能性大的突变位点:①C.2501T>C（SIFT:Tolerated0.28,PolyPhen-2:Benign/0.047)②C.61C>T(SIFT:Tolerated0.45,PolyPhen-2:benign/0.209)③C.191G>A(SIFT:Tolerated0.21,PolyPhen-2:benign/0.051④C.26C>A(SIFT:Damaging0.02,PolyPhen-2:benign/0.109);
　　5.通过小鼠模型,把上述软件预测出的突变位点,通过免疫荧光观察其表达位置:全部在小鼠肝细胞膜膜内表达的突变位点:C.1814T>C（SIFT:Damaging0,PolyPhen-2:probably/1);大部分在小鼠肝细胞膜膜内表达的突变位点:C.1256G>A(SIFT:Damaging0,PolyPhen-2:probably/0.994);其余突变位点在小鼠肝细胞膜上有较多表达,致病可能性还有待进一步验证及综合分析;
　　6.通过构建转基因斑马鱼,发现突变载体不能纠正ABCC6基因缺失的突变位点:①C.11C>A(SIFT:Damaging0,PolyPhen-2:probably/0.957)②C.1256G>A(SIFT:Damaging0,PolyPhen-2:probably/0.994)③C.26C>A（SIFT:Damaging0.02,PolyPhen-2:benign/0.109)④C.2843T>C（SIFT:Damaging0,PolyPhen-2:probably/0.988)⑤C.2126A>G(SIFT:Damaging0,PolyPhen-2:probably/0.916)⑥C.373G>A(SIFT:Damaging0.01,PolyPhen-2:probably/0.997)⑦C.61C>T(SIFT:Tolerated0.45,PolyPhen-2:benign/0.209)⑧C.2501T>C(SIFT:Tolerated0.28,PoluPhen-2:Benign/0.047);突变载体能够部分纠正ABCC6基因缺失的突变位点:C.191G>A(SIFT:Tolerated0.21,PolyPhen-2:benign/0.051)。
　　结论：
　　1.收集的PXE患者以女性居多,发病年龄小,颈部、腋窝为最常见的发病部位;通过皮肤组织病理学检查一般能及时做出诊断;对患者眼底和心血管系统并发症检查和积极地随访十分必要和重要;
　　2.欧美人群PXE患者常见的23-29区大片缺失的突变在我们所收集的样本中均没有被发现,23-29区大片缺失的突变可能不是中国汉族PXE患者的常见致病突变;3.新发现5个中国汉族PXE患者ABCC6基因缺失或插入致病突变位点:C.4254 delG,C.30delG,C.196_197 inT,C.3586delC,C.196delT;
　　4.利用动物模型鉴定出9个中国汉族PXE患者ABCC6基因新的致病错义突变位点:C.1814T>C,C.11C>A,C.1256G>A,C.26C>A,C.2843T>C,C.2126A>G,C.373G>A C.61C>T,C.2501T>C。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

1 弹力纤维假黄瘤临床及流行病学特点

2 弹力纤维假黄瘤的致病基因与发病机制

正文

第一部分中国弹力纤维假黄瘤临床病理特征

1病例的收集与数据统计

2结果

3 讨论

小 结 一

第二部分 中国汉族PXE患者ABCC6基因新致病突变的研究

1.实验材料与仪器

2 方法（图2-1）

3 结果

4 讨论

小 结 二

参考文献

个人简历和研究成果

致谢