丙型肝炎病毒感染者miR-181a对CD4+T细胞衰老的调节作用及信号传导

摘要

T细胞在病毒清除和持续感染的过程中发挥重要作用。然而，病毒感染过程中调控 T细胞的发挥免疫应答的具体机制还不完全清楚。miRNA是基因转录后调控的重要分子，目前被认为是控制生物活动的关键调节器。有证据表明一些 miRNA能通过直接作用于 HCV基因，或间接通过病毒相关的宿主信号通路来调节 HCV复制，并与HCV引起的肝病的发病有密切关系。本研究的目的集中在miR-181a分子，探讨该分子对 HCV感染者 CD4+T细胞的衰老的调控作用机制。
　　方法：分离 HCV感染者或健康人外周血 CD4+T细胞，miScript miRNA array检测HCV感染者和健康人CD4+T细胞 miRNA差异表达；流式细胞术和实时定量 RT-PCR检测 CD4+T细胞上双特异性磷酸酶6（DUSP6）和IL-2的表达；并用纯化的CD4+T细胞，转化miR-181a precursor,流式检测 IL-2的表达，RT-PCR检测 DUSP6的表达；应用阻断剂抑制 DUSP6表达后，流式细胞术分别检测CD4+T上CD69、CD25和IL-2的表达，同时用 RT-PCR测 DUSP6表达，然后分析它们之间的关系。
　　分离 HCV感染者或健康人外周血CD4+T细胞，检测其端粒长度和衰老细胞染色；流式细胞术检测 CD4+T细胞 SIRT1表达，Western Blot检测ΔNp63在CD4+T细胞上表达；电转染siRNA法沉默 HCV患者 CD4+T细胞中ΔNp63或SIRT1或者重构miR-181a的表达，Flow-FISH法检测CD4+T细胞端粒长度，PCR-ELISA法检测端粒酶活性，染色与衰老相关的β半乳糖苷酶(SA-β-gal)，流式检测增殖相关的 EdU。
　　结果表明：与健康对照者相比，HCV慢性感染者的 CD4+T细胞表达miR-181a下降，DUSP6表达过高，并且 miR-181a下降与DUSP6升高水平负相关。复原慢性HCV感染者CD4+T细胞的 miR-181a，或阻断 DUSP6表达能恢复T细胞的免疫活性，如CD25和CD69表达升高，IL-2分泌增多以及CD4+T细胞增殖能力提高。
　　进一步研究表明：HCV诱导的 T细胞衰老，可被ΔNp63-miR181a-Sirt1通路对抗调节。和年龄匹配的健康对照者相比，慢性 HCV感染者 T细胞更衰老。实验揭示转录因子ΔNp63的升高能导致 miR-181a的下降，进而过表达抗衰老分子 SIRT1。在HCV患者 CD4+T细胞中沉默ΔNp63或 SIRT1以及重构miR-181a的表达能加速T细胞衰老，表现为端粒酶活性下降，端粒长度缩短，增加衰老相关的β半乳糖苷酶(SA-β-gal)表达，以及与增殖相关的 EdU掺入下降。意外的是，上述处理后 CD4+T细胞的 IL-2表达增加，主要是由于Foxp3+Treg（regulatory T cells）细胞百分率下降，而 Foxp3-Teff（effectors T cells）细胞百分率增加或不变。
　　这些发现提示HCV可能利用miR-181a信号通路调控T细胞的衰老/耗竭，导致 HCV持续慢性感染，维持相对的免疫稳态；该结果还提示可通过升高慢性 HCV感染者 miR-181a，恢复受损的 T细胞反应，为治疗慢性持续 HCV感染提供了新的思路；该研究思路为其他慢性病毒感染性疾病研究 T细胞衰老提供参考意义。

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缩略语表

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前言

文献回顾

一、miRNA和 HCV复制

二、HCV与免疫耗竭

三、HCV与免疫衰老

四、衰老评价方法

实验一HCV感染者CD4+T细胞miR-181a抑制DUSP6表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二ΔNp63-miR-181a-SIRT1信号通路调节HCV感染患者CD4+T细胞衰老机制

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢