MCUR1介导线粒体钙稳态重塑调控ROS产生促进肝癌生长的作用机制研究

摘要

线粒体钙稳态对线粒体功能及细胞的影响至关重要，线粒体钙维持胞浆钙离子浓度动态平衡，是线粒体呼吸功能的重要调节因素，钙离子失衡导致细胞凋亡。线粒体钙稳态重塑是多种疾病发生的主要原因，但这一改变是否在肿瘤恶性进展中发挥关键作用尚无明确报道。我们的研究团队首次发现：新近报道的线粒体钙离子摄取关键调节分子MCUR1，促进肝癌细胞粒体钙稳态摄取，其表达水平在肝癌组织细胞中异常升高，MCUR1高表达能够通过加速细胞增殖抑制线粒体依赖的内源性细胞凋亡而促进了肝癌细胞的生长能力，并且与肝癌病人的不良预后相关。文献报道，线粒体的钙离子环境是调控细胞活性氧 ROS生成的关键因素，而活性氧ROS作为胞内重要的第二信使，能够激活包括与肿瘤细胞增殖，凋亡，转移与肿瘤细胞的血管生成相关的多种关键信号通路，最终导致恶性肿瘤发生。我们进一步研究发现MCUR1介导的线粒体钙稳态重塑导致肝癌细胞活性氧ROS水平上调，这一改变与其下游P53降解，AKT/MDM2信号通路活化密切相关。基于此，我们提出假说：MCUR1上调引发线粒体钙稳态重塑，通过调控胞内第二信使ROS生成影响其下游AKT/MDM2介导的P53降解信号通路，最终促进肝癌的恶性进展。
　　【目的】
　　本课题以肝癌为研究对象，选择线粒体钙离子摄取关键调节分子MCUR1，明确MCUR1介导的线粒体钙稳态重塑是否参与对肝癌生长的调控，并探索MCUR1介导的线粒体钙稳态重塑调控肝癌生长的作用机制。
　　【方法】
　　1.利用免疫组化实验分析MCUR1以及P53在原发性肝癌临床标本的表达及相关性。
　　2.利用MTS法测定细胞生长曲线、克隆形成实验、Annexin-V凋亡检测、流式细胞周期检测、EdU细胞增殖等实验方法，分析MCUR1对肝癌细胞增殖凋亡及生长的影响。
　　3.利用裸鼠皮下荷瘤实验，分析MCUR1在体内对肝癌生长的影响。
　　4.利用Rhod-2, Fluo-4活细胞染色，分析MCUR1对肝癌细胞线粒体基础钙离子水平以及线粒体对胞浆钙的缓冲作用的影响。
　　5.利用DCF及MitoSox染料对细胞ROS及线粒体ROS进行染色，分析MCUR1对肝癌细胞线粒体ROS生成的影响。
　　6.利用WesternBlot检测凋亡相关分子，以及增殖相关分子的表达改变，分析MCUR1介导的线粒体钙稳态重塑促进肝癌细胞的生长的作用机制。
　　【结果】
　　第一部分：通过对原发性肝癌临床标本进行分析，发现MCUR1在肝癌组织中表达上调，与肝癌不良预后相关。通过采用MTS法测定细胞生长曲线、克隆形成实验、Annexin-V凋亡检测、流式细胞周期检测、EdU细胞增殖等实验方法，发现肝癌细胞中MCUR1通过抑制细胞凋亡并且加速细胞增殖而促进肝癌细胞的生长。通过进行裸鼠皮下荷瘤实验，证实MCUR1通过抑制肝癌凋亡，加速肝癌增殖，而促进肝癌的生长。
　　第二部分：通过Rhod-2, Fluo-4染色检测线粒体钙以及胞浆钙，发现：MCUR1能够促进线粒体钙离子摄入，提升线粒体基础钙离子浓度，并且在应急状态下线粒体对胞浆钙的缓冲力。通过对线粒体单向转运体MCU进行干预处理，发现MCUR1依赖于MCU促进肝癌细胞线粒体钙的摄取。
　　第三部分：通过对细胞ROS以及线粒体ROS的检测，发现MCUR1能够促进肝癌细胞线粒体ROS生成。通过线粒体的ROS清除剂Mito-TEMPO对细胞中线粒体ROS进行清除，以及线粒体钙清除载体PV-Mito对线粒体内的钙离子进行清除，发现MCUR1介导的线粒体钙离子稳态重塑通过促进肝癌细胞线粒体ROS生成，而抑制细胞凋亡促进细胞增殖。
　　第四部分：通过检测凋亡相关分子，增殖相关分子，P53，AKT及MDM2磷酸化的检测，证实：MCUR1介导的线粒体钙稳态重塑通过ROS/AKT/MDM2途径使P53失活促进肝癌细胞生长。
　　【结论】
　　本课题研究发现：MCUR1介导肝癌线粒体钙离子摄入增强，重塑的线粒体钙稳态影响ROS的生成，通过ROS/AKT/MDM2途径使P53失活，调控肝癌的增殖凋亡，最终促进肿瘤进一步恶化。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1. 肝癌的发生与调控机制研究

2 线粒体钙稳态的国内外研究现状

3. ROS的国内外研究现状

4 MCUR1（mitochondrial calcium uniporter regulator 1）的国内外研究现状

第一部分MCUR1表达与肝癌预后分析及其在肝癌细胞生长中的作用

1材料

2方法

3.结果

4.讨论

第二部分MCUR1调控肝癌细胞线粒体钙离子稳态的作用研究

1材料

2方法

3结果

4.讨论

第三部分MCUR1介导的线粒体钙稳态重塑调控线粒体ROS生成及肝癌生长的作用研究

1材料

2方法

3结果

4.讨论

第四部分 线粒体钙稳态重塑介导的ROS生成促进肝癌细胞生长的信号通路及分子机制研究

1材料

2方法

3结果

4.讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和科研成果

致谢