缺血预处理对大鼠缺血再灌注心肌损伤修复的影响及修复细胞来源的实验研究

摘要

目的：
　　缺血预处理(Ischemic Preconditioning, IPC)是一种对缺血再灌注心肌的内源性保护机制，主要通过抑制心肌细胞凋亡减少心肌梗死面积。但IPC是否能够通过刺激细胞增殖，补充心肌细胞数量来修复受损心肌组织尚不明确。本研究通过建立大鼠缺血预处理模型，对细胞增殖指标Ki67进行检测，观察心肌细胞的增殖；通过检测特异心肌早期转录因子Nkx2.5、GATA4以及干细胞标记物c-Kit的表达水平，探究增殖细胞的来源。
　　方法：
　　1．动物模型建立。雄性健康Vista大鼠，8周龄(220±25g)，随机分为3组：假手术组(Sham)、缺血再灌注组(I/R)、缺血预处理组(IPC)。于术后1天、3天、7天、14天处死大鼠并取材，分别对相关指标进行检测。
　　2．心肌组织的形态学检测。HE染色法观察比较Sham、I/R和IPC组心肌组织的损伤程度。
　　3．细胞增殖指标Ki67的检测。采用免疫荧光双标染色法和免疫组织化学SABC法检测Ki67在处理组各时间点的表达情况，并镜下随机选取十个视野对阳性细胞数进行统计。
　　4．心肌组织中新生心肌细胞来源的指标分别用RT-PCR、western blot、免疫组织化学法检测。
　　(1)采用RT-PCR检测特异心肌早期转录因子Nkx2.5、GATA4以及干细胞特异标记物c-Kit的表达；
　　(2)运用western blot检测GATA4以及干细胞特异标记物c-Kit的表达；
　　(3)组织水平利用免疫组织化学SABC法检测GATA4、Nkx2.5的表达，免疫荧光双标染色法检测各时间点GATA4、Nkx2.5、c-Kit的表达，统计阳性细胞数。
　　结果：
　　1．模型的建立。缺血成功判定：结扎过程ST段抬高；恢复血液的再灌，ST段恢复至正常。
　　2．肌组织HE染色。对各组心肌组织行HE染色，于镜下进行观察，Sham组心肌病理改变不明显，肌纤维走行自然，排列整齐；I/R组心肌细胞明显膨大，部分细胞胞膜及细胞核发生溶解，排列紊乱、炎性细胞浸润显著，而IPC组病理改变明显减轻，肌纤维的排列相对整齐，细胞的肿胀减轻较明显，炎性细胞在组织内浸润减少。
　　3．心肌细胞增殖指标Ki67检测结果。
　　(1)免疫组织化学SABC法检测Ki67：Sham组的阳性细胞非常少，I/R组和IPC组的阳性细胞数在术后增多，但程度不同。与Sham组比较，术后各时间点IPC组阳性细胞显著增多具有统计学意义(P<0.01)。与I/R组比较，IPC组Ki67阳性细胞数在术后第三天和第七天具有统计学意义(P<0.01)。
　　(2)Ki67免疫荧光双标染色法检测检测结果：IPC组与Sham组比较，在术后第一天，第三天和第七天阳性细胞数差异显著(P<0.05)；术后第三天、第七天IPC组和I/R组比较也具有统计学意义(P<0.05)。
　　4．心肌组织中新生心肌细胞来源的检测结果
　　(1)mRNA水平检测c-Kit、Nkx2.5、GATA4的表达结果：
　　经RT-PCR检测，IPC组和I/R组，c-Kit、Nkx2.5和GATA-4的表达趋势相近，确定IPC组c-Kit表达量峰值在第三天， I/R组出现在第七天，且具有统计学意义(P<0.01)。
　　(2)蛋白水平检测c-Kit、GATA4的表达结果
　　Sham组c-Kit、GATA4有微量的表达。IPC和I/R组表达量均有显著增加。IPC与I/R组比较，二者表达水平于第一天，第三天和第七天比较有统计学意义(P<0.05)。
　　(3)组织水平检测Nkx2.5、GATA4的表达
　　免疫组织化学SABC法检测Nkx2.5、GATA4表达：对照组Nkx2.5、GATA4几乎没有阳性结果，IPC组和I/R组阳性单位增加，其在术后显著大于Sham组，IPC组在第一天，第三天和第七天与I/R组比较具有统计学意义(P<0.05)。
　　免疫荧光双标法检测c-Kit、Nkx2.5、GATA4（c-Kit分别与Nkx2.5、GATA4组合）：处理后各时间点Sham组两指标阳性单位均显著少于IPC组和I/R组(P<0.05)。组间比较，术后第一天，第三天和第七天阳性细胞数比较具有统计学意义，且IPC组的阳性细胞数在第三天达到峰值(P<0.05)。
　　结论：
　　1．IPC可有效减少心肌梗死面积，减轻心肌梗死病理学改变。
　　2．IPC可以增加细胞增殖特异性指标Ki67的表达，促进心肌细胞再生。
　　3．IPC及I/R使得Nkx2.5、GATA4、c-Kit阳性细胞数增加，但二者峰值出现时间不同，IPC组在第三天，I/R组在第七天，且IPC较I/R更能促进相关指标的阳性细胞数量增加。
　　4．步判断c-Kit阳性细胞可能作为新生心肌细胞的来源，分化为心肌细胞，参与受损心肌细胞的修复。

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前言

第一部分 缺血预处理模型的建立

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

第二部分 缺血预处理对心肌组织细胞增殖指标Ki67表达的影响及新生心肌细胞来源的实验研究

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

参考文献

综述: 心肌细胞增殖、分化介导的心肌再生相关机制研究进展

致谢

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