NgAgo-gDNA系统基因表达调控功能的验证及其抗肿瘤作用的初步研究

摘要

目的：在哺乳动物细胞中验证 NgAgo-gDNA系统是否具有基因编辑和调控基因表达的功能；对利用NgAgo-gDNA系统靶向致癌突变基因杀灭肿瘤细胞进行初步探索研究。
　　方法：提取肿瘤细胞基因组DNA，通过PCR的方式扩增基因突变序列。将扩增片段克隆入T载体中，测序突变序列，鉴定肿瘤细胞系突变位点。构建致癌突变基因与EGFP共表达载体，将共表达载体、NgAgo载体以及靶向突变部位或 EGFP的 gDNA通过Lipofectamine2000瞬时转染到293FT细胞中，流式检测EGFP的表达。以EGFP荧光表达率为指标判断基因编辑的效果。之后，探究在不同血清浓度（10％、5%、2.5%）及不同效靶比（EGFP：NgAgo-gDNA=1：3、1：6、1：12、1:24）条件下的基因编辑效果。随后，我们对实验条件进行优化。在进行基因编辑时，我们常使用EGFP作为报告分子。但由于EGFP蛋白相对稳定，降低了其对微弱基因编辑效果的报告敏感性。为此，我们的研究尝试构建EGFP-PEST融合蛋白表达载体，利用PEST序列可通过泛素蛋白酶体途径降解蛋白的功能，加快EGFP的降解，从而使得EGFP能够更为灵敏的指示基因编辑效果，为实现基因编辑的可视化筛选奠定基础。因此，以NFATx6-mPro-EGFP-PEST-YES为模板，PCR扩增EGFP-PEST序列，克隆入逆转录病毒载体pQCXIP-EGFP-N1构建pQCXIP-EGFP-PEST-N1，病毒包装后感染293FT细胞获得稳定细胞系。用蛋白酶体抑制剂（MG-132）处理细胞，Western Blot检测 EGFP的表达变化。成功建立稳定表达pQCXIP-EGFP-PEST-N1的293FT后，将NgAgo的表达载体以及靶向EGFP的gDNA通过Lipofectamine2000瞬时转染到293FT细胞中，流式检测EGFP的表达，分选出俩群差异表达EGFP的细胞，分别提取基因组DNA和RNA， PCR扩增基因突变部位，测序突变序列，逆转录RNA，利用qPCR检测RNA水平的表达。最后，利用脂质体Lipofectamine2000将NgAgo以及靶向突变序列的gDNA转入到肿瘤细胞中，连续72小时监测肿瘤细胞增殖。
　　结果：⑴所选择的肿瘤细胞系中，大部分细胞系均与文献报道的突变位点相符，仅H820细胞系并没有发现文献报道的T790M的突变。⑵在不同血清浓度及不同效靶比条件下，NgAgo-gDNA系统靶向突变部位或EGFP后，EGFP的荧光表达率未见明显降低。⑶瞬转靶向EGFP的NgAgo-gDNA到稳定表达EGFP-PEST的293FT细胞系中，通过流式分析发现EGFP的荧光表达强度有所降低，但基因序列分析未见DNA序列改变。⑷NgAgo-gDNA系统可以靶向致癌突变抑制肿瘤细胞的增殖。
　　结论：在哺乳动物细胞中，NgAgo-gDNA系统可以敲低基因表达，但基因编辑能力在本研究中未得到证实；基于NgAgo-gDNA系统治疗肿瘤值得进一步研究。

目录

声明

常用缩写词中英文对照表

前言

第一部分 肿瘤细胞系突变基因位点的鉴定

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结 果

2.1 PCR扩增突肿瘤细胞基因组突变部位

2.2测序结果

3 讨 论

4 结 论

第二部分 NgAgo-gDNA系统在哺乳动物中基因编辑效果的验证

1.材料与方法

1.1主要材料

1.2 方法

2 结 果

2.1.初次验证NgAgo-gDNA系统在293FT细胞中的基因编辑效果

2.2 探究在不同条件下NgAgo-gDNA系统在293FT细胞中的基因编辑效果

2.3. NgAgo-gDNA系统靶向EGFP-PEST后，基因编辑效果的验证

3 讨 论

4 结 论

第三部分 NgAgo-gDNA系统对肿瘤细胞增殖的影响

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

参考文献

综述:基于基因编辑技术的肿瘤基因疗法

致谢

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