基于中空纤维细胞捕获法和中空纤维液相微萃取法研究白芷中香豆素类抗癌活性成分及其药代动力学

摘要

目的：
　　建立中空纤维细胞捕获-高效液相色谱法（Hollow fiber cell fishing with high performance liquid chromatography，HFCF-HPLC）对白芷中香豆素类成分进行体内外抗癌活性成分筛选和鉴定；建立中空纤维液相微萃取-高效液相色谱法（Ho llo w fibe r liquid phase microextraction with HPLC，HFLPME-HPLC）对白芷中筛选出的香豆素类活性成分进行体内外含量测定及药代动力学研究；结合香豆素类成分的抗癌活性筛选、鉴定、含量测定及多组分药动学，沟通白芷中香豆素类抗癌活性成分在体内外的关系，初步寻找真正抗癌的香豆素类成分，为阐明白芷中香豆素类的抗癌药效物质基础提供理论基础和试验依据。
　　方法：
　　（1）对可能影响 HFCF-HPLC法的的各种因素，如分别种植于纤维内壁上的人卵巢癌细胞SKOV-3，人肾癌细胞ACHN，人肝癌细胞HepG-2的生长状态、存活率、乙醇浓度对HepG-2细胞存活率的影响、纤维活性中心或培养液对筛选结果的影响、筛选出的活性成分保留时间和相对峰面积的重现性等，进行考察和优化。在最佳HFCF-HPLC条件下，以补骨脂素、佛手苷内酯、氧化前胡素、欧前胡素和异欧前胡素作为模型化合物，将分别种植3种癌细胞的中空纤维或充满HepG-2细胞膜、细胞器混悬液的纤维插入白芷醇提液、水煎液及含药血浆或含药肝、肾组织匀浆中，对白芷中的香豆素类成分进行体内外活性成分筛选和鉴定，初步明确香豆素类成分与3种癌细胞的结合能力。（2）对影响HF LPM E-HPLC法的因素，如萃取剂种类及其比例、样品相 pH、萃取时间和转速等，进行条件优化，对该法的线性范围、检测限、定量限、精密度和准确度，进行方法学考察。在最佳 HFLPM E-HP LC条件下，以补骨脂素、佛手苷内酯、氧化前胡素、欧前胡素和氧化前胡素作为模型化合物，利用HFLPM E-HP LC法对白芷中筛选出的抗癌活性成分，特别是微量活性成分，进行含量测定；并用该法对白芷灌胃给药后的多成分药代动力学进行研究。结合白芷香豆素类成分的抗癌活性筛选、鉴定、含测及多组分药动学研究的结果，探讨白芷在体内真正起效的香豆素类抗癌活性成分。
　　结果：
　　在最佳HFCF和HFLPME偶合HPLC法实验条件下，对白芷中香豆素类成分进行研究，可以得出：（1）白芷药材中与3种癌细胞结合的香豆素类成分至少有花椒毒酚、花椒毒素、补骨脂素、佛手苷内酯、氧化前胡素、欧前胡素和异欧前胡素，其中能够定量的香豆素类成分有补骨脂素（1.36μg/g）、佛手苷内酯（3.05μg/g）、氧化前胡素（22.30μg/g）、欧前胡素（7.78μg/g）和异欧前胡素（2.83μg/g）；（2）白芷口服灌胃给药后，体外筛选出的7种香豆素类成分均能吸收入血，之后测得含药血浆中补骨脂素、佛手苷内酯、氧化前胡素、欧前胡素和异欧前胡素的Cmax（The mean peak concentration）分别是0.36、0.23、0.08、1.20和0.47μg/mL，其中作用于ACHN和 HepG-2细胞的成分仅有花椒毒酚、花椒毒素、佛手苷内酯和欧前胡素；（3）在含药肾组织中能检测到活性成分有补骨脂素（0.72μg/g）、佛手苷内酯（0.46μg/g）、欧前胡素（0.22μg/g）、异欧前胡素（0.62μg/g）以及花椒毒酚和花椒毒素，其中仅花椒毒酚、花椒毒素、佛手苷内酯和欧前胡素能作用于ACHN细胞；（4）在含药肝组织中能检测到活性成分有氧化前胡素（1.03μg/g）、欧前胡素（0.41μg/g）、异欧前胡素（0.10μg/g）以及花椒毒酚和花椒毒素，仅有花椒毒酚和花椒毒素能与HepG-2细胞作用；（5）利用HFLPM E-HP LC法对白芷口服灌胃后的多成分药代动力学进行研究，同时测定其药代动力学参数。
　　结论：
　　HFCF和HFLPME偶合HPLC法成功应用于白芷中微量香豆素类化合物的抗癌活性成分筛选、定性、含量测定及多成分药代动力学研究。在本实验条件下，白芷在体外筛选出的抗癌香豆素类成分是花椒毒酚、花椒毒素、补骨脂素、佛手苷内酯、氧化前胡素、欧前胡素和异欧前胡素，它们与细胞的结合能力与其在白芷中的含量无关；体内筛选结果与体外筛选结果有一定的差异，血浆中
　　能够与 ACHN细胞和 HepG-2细胞作用的是花椒毒酚、花椒毒素、佛手苷内酯和欧前胡素，肾组织中仅花椒毒酚、花椒毒素、佛手苷内酯和欧前胡素能与ACHN细胞作用，肝组织中只有花椒毒酚和花椒毒素能与 HepG-2细胞作用，且筛选出的活性成分在相应的靶组织可以保持一定有效浓度，由此可见，白芷中的微量香豆素类成分具有抗肾癌 ACHN细胞和肝癌 HepG-2细胞的作用；但5种香豆素类成分在体内的达峰时间相似，长期服用白芷药材可能会引起毒性成分的累积。另外，HFCF和 HFLPME偶合 HPLC法可用来研究中药中抗癌生物活性成分，特别是微量活性成分。HFCF和 HFLPME的结合为我们研究中药抗癌活性的药效物质基础提供一个新思路和新方法。
　　本课题承蒙国家青年科学基金“中空纤维/石墨烯/有机溶剂固-液协同单元阵列微萃取及其在中药活性成分分析中的应用”（No.81302734）支持。

目录

声明

常用缩写词中英文对照表

前言

第一部分 白芷中香豆素类抗癌活性成分的体内外研究

1 材料与方法

1. 1仪器与设备

1. 2对照品和试剂

1. 3实验动物

1. 4溶液的制备

1. 5 纤维的制备

1. 6 色谱条件和质谱条件

1. 7活性成分筛选

2 结 果

2.1 HFCF偶合HPLC验证

2.2 HFCF-HPLC的应用

3 结 论

第二部分 白芷中香豆素类活性成分含量测定及体内分布

1 材料与方法

1. 1仪器与设备

1. 2对照品和试剂

1. 3实验动物

1. 4溶液的制备

1. 5 纤维的制备

1. 6 色谱条件

1. 7 体内外白芷含量测定

2 结 果

2.1 HFLPME-HPLC条件优化

2.2 HFLPME-HPLC方法学考察

2.3 HFLPME-HPLC法的应用

3 结 论

第三部分 白芷多成分药代动力学研究

1 材料与方法

1. 1仪器与设备

1. 2对照品和试剂

1. 3实验动物

1. 4 纤维的制备

1. 5 色谱条件

1. 6 溶液的制备

2 结 果

2.1 HFLPME-HPLC条件优化

2.2 HFLPME-HPLC方法学考察

2. 3白芷中多组分药代动力学研究

2. 4白芷多成分药代动力学研究方法及药代动力学参数比较

3 结 论

参考文献

综述:白芷活性成分研究

致谢

在学期间承担/参与的科研课题与研究成果

个人简历