芦笋老茎栽培食用菌和培养料堆制过程中微生物多样性的研究

摘要

芦笋(Asparagus officinalis L.)为百合科天门冬属多年生草本植物。在每年的芦笋收获季节过后，大量的芦笋老茎没有加以充分利用，只是任其自然腐败，或直接焚烧，既造成资源的极大浪费，也带来了严重的环境污染问题。因此，如何合理利用芦笋老茎这种农业废弃物，是一个亟待解决的问题。由于多种农业废弃物可以用来栽培食用菌，所以作为食用菌培养料是利用芦笋老茎的有效途径之一。本论文计划进行利用芦笋老茎栽培鲍鱼菇、黄白侧耳和巴西蘑菇的实验研究。重点针对芦笋老茎培养料堆制发酵期间的微生物多样性展开研究。蘑菇堆料是一个复杂而又独特的微生态系统，内部栖息着多种多样的微生物。依靠微生物在适宜条件下的代谢作用，堆料中的生物大分子物质被分解、转化，堆料的腐熟速度和大分子物质的降解程度都与堆料内的微生物种类和数量直接相关。由于芦笋老茎是一种不同于稻草、麦秆等秸秆的原料，所以其堆制发酵期间的微生物群落及其演替变化规律也必然不同于其他原料的堆料。如果要建立和完善针对芦笋老茎的堆制发酵工艺，进而得到一种高质量的蘑菇培养料，关于芦笋老茎堆制发酵期间微生物多样性的研究是非常必要的。在研究方法上，本论文计划应用16S rDNA文库技术分析芦笋老茎堆料微生物的多样性，应用实时荧光定量PCR技术对堆料发酵期间微生物的菌群演替进行定量分析。本论文利用芦笋老茎这种农业废弃物栽培食用菌和对芦笋老茎堆料发酵过程中的微生物多样性进行研究，是一个全新的尝试，一方面可以填补关于芦笋老茎栽培食用菌和芦笋老茎堆料微生物多样性的研究空白，为下一步利用芦笋老茎栽培食用菌、制备芦笋老茎堆料发酵菌剂以及调控堆料过程提供理论依据，另一方面对于探讨一条规模化利用芦笋老茎资源的新途径，促进农村生态循环经济发展具有重要意义。
　　首先进行了用芦笋老茎栽培鲍鱼菇和黄白侧耳的初步研究，分析了芦笋老茎培养料对鲍鱼菇和黄白侧耳多糖含量和抗氧化性的影响。在没有添加其他辅料的芦笋老茎培养料上，黄白侧耳的产量（199 g/袋）比鲍鱼菇的产量（140 g/袋）更高;在芦笋老茎培养料中添加适量的葡萄糖、MgSO4和K2HPO4有利于黄白侧耳子实体的发育，能导致黄白侧耳产量的增加;而对于鲍鱼菇来说，在芦笋老茎培养料中添加辅助性碳源和无机盐反而会导致产量的降低。在没有添加其他辅料的芦笋老茎培养料上，鲍鱼菇子实体多糖含量明显比黄白侧耳高。与对照相比，在芦笋老茎培养料中添加辅助性碳源和无机盐对黄白侧耳子实体多糖含量没有明显的影响，但却能导致鲍鱼菇子实体多糖含量的显著降低。从DPPH自由基清除能力的EC50值和还原能力的EC50值可以看出，在没有添加其他辅料的芦笋老茎培养料上，鲍鱼菇的抗氧化性强于黄白侧耳;添加蔗糖和MgSO4有利于提高两种蘑菇的抗氧化性。
　　设计了以芦笋老茎为主料，棉籽壳、玉米芯、干牛粪和杂木屑为辅料的4种培养料来栽培巴西蘑菇，采用二次发酵法制备培养料，玉米秸秆培养料作为对照。结果表明巴西蘑菇在芦笋老茎和玉米秸秆培养料上的产量没有明显差别;添加棉籽壳或干牛粪的芦笋老茎培养料其巴西蘑菇产量明显高于添加杂木屑或玉米芯的芦笋老茎培养料。芦笋老茎培养料上栽培得到的巴西蘑菇子实体的抗氧化性明显高于对照培养料上栽培得到的子实体的抗氧化性，但多糖含量却明显低于对照;4种辅料相比较，棉籽壳和玉米芯比干牛粪和杂木屑更有利于提高巴西蘑菇子实体的多糖含量，棉籽壳比玉米芯、干牛粪和杂木屑更有利于提高巴西蘑菇的抗氧化性。
　　采用稀释涂布法对芦笋老茎堆料不同发酵阶段6个样品中的嗜热可培养微生物进行了分离，共分离到菌落形态有明显区别的26个细菌菌株、23个放线菌菌株和27个真菌菌株。根据16S rDNA序列分析结果，26株细菌中13株为芽孢杆菌属（Bacillus），4株为假黄色单胞菌属（Pseudoxanthomonas），1株为短芽孢杆菌属（Brevibacillus），1株为肠杆菌属（Enterobacter），1株为Paenibacillus属，1株为短波单胞菌属（Brevundimonas），1株为不动杆菌属（Acinetobacter），1株为Amaricoccus属，1株为副球菌属(Paracoccus)，2个菌株在GenBank数据库中未找到与其相似的已知细菌属的序列，分类地位待定。根据16S rDNA序列分析结果，23株放线菌中，4株的序列与白浅灰链霉菌（Streptomyces albogriseolus）同源性最高，5株的序列与热普通链霉菌（Streptomyces thermovulgaris）同源性最高，2株的序列与Streptomyces pseudogriseolus同源性最高，1株的序列与Streptomyces espinosus同源性最高，有11株在GenBank数据库中未找到与其相似的已知链霉菌种的序列，分类地位待定。根据菌落形态和个体形态特征观察结果，27株真菌中12株为腐质霉属(Humicola)，8株为青霉属（Penicillium），2株为链格孢霉属（Alternaria），1株为拟青霉属（Paecilomyces），4株为毛霉属（Mucor）。从这些结果可以看出，芦笋老茎堆料中的优势的嗜热可培养微生物主要是芽孢杆菌（Bacillus spp.）、假黄色单胞菌（Pseudoxanthomonas spp.）、白浅灰链霉菌（Streptomyces albogriseolus）、热普通链霉菌（Streptomyces thermovulgaris）、腐质霉（Humicola spp.）、青霉（Penicillium spp.）和毛霉（Mucor spp.）。
　　为了能高效提取芦笋老茎堆料样品中微生物的总基因组DNA，从DNA提取和PCR扩增效果等方面对4种DNA提取方法（即溶菌酶法、蛋白酶K-CTAB法、试剂盒法和改进的试剂盒法）进行了比较研究。琼脂糖凝胶电泳显示，溶菌酶法可以提取到样品中的基因组DNA，有一定程度的弥散，且基因组的含量较低，对蛋白质的去除率不高。蛋白酶K-CTAB法对于基因组DNA的损伤较小，提高了蛋白质的去除率，较好地提取到条带单一的基因组DNA，但是浓度仍然很低。试剂盒法成功地提取到了浓度很高的基因组DNA，稍有弥散。改进的试剂盒法也较好地提取到了基因组DNA，但是弥散得很厉害。用溶菌酶法提取的基因组DNA为模板对16S rDNA片段进行了PCR扩增，结果均无目的产物。用蛋白酶K-CTAB法得到的基因组DNA为模板进行PCR扩增后，在约1600bp处得到了目的产物，但是浓度却很低。用试剂盒法提取的DNA为模板进行PCR扩增时，在约1600bp处扩增到了较浓的单一条带，并且大小符合16S rDNA片段的理论值。用改进的试剂盒法提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增时没有得到任何产物。这些实验结果表明4种方法均可以提取到芦笋老茎堆料样品中微生物的总基因组DNA，试剂盒法效果最好，其次是蛋白酶K-CTAB法，另外两种方法提取效果无明显差异;用试剂盒法提取到的总基因组DNA进行的16S rDNA片段的PCR扩增效果最好。
　　分别构建了芦笋老茎堆料不同发酵阶段6个样品的细菌16S rDNA克隆文库，并进行了文库中细菌多样性及其系统发育关系的分析。共获得228个细菌16S rDNA克隆，运用微生物分类学和生物信息学的方法对16S rDNA克隆文库进行了分析，结果表明:228个细菌16S rDNA克隆可分为5大类群，即变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和未确定分类地位(Unidentified)的类群。第一优势类群——放线菌门的16S rDNA克隆在堆料发酵的全部阶段都能够被检出，并且占到总数的33％，表明放线菌在芦笋老茎堆料发酵过程中起着重要的作用。第二优势类群——变形菌门又分为α、β、γ-变形菌亚群，其中γ-变形菌亚群具有支配地位。拟杆菌16S rDNA序列在发酵中期（建堆后第11天）并没有被克隆出来。文库覆盖率(Coverage C)、稀疏曲线(Rarefactioncurve)、香侬指数(Shannon-Wiener index)、物种多样性指数（Schao(1)）和文库相似度指数(Cs)等文库评价指数表明，除个别文库之外，所建文库能较好地反映芦笋老茎堆料中绝大部分细菌的多样性。
　　与传统方法及其它微生物定量方法相比，实时荧光定量PCR可以对样品中的DNA进行直接分析，从而达到对微生物定量的目的。该方法不仅减少了培养计数各个环节中的误差，同时还具有特异性强、定量准确、重复性好、无PCR后处理的污染等优点。本实验利用实时荧光PCR技术对芦笋老茎堆料不同发酵阶段的3种嗜热放线菌进行了定量分析。结果表明，Thermobifida fusca、白浅灰链霉菌（Streptomycesalbogriseolus）和热普通链霉菌（Streptomyces thermovulgaris）在整个堆料发酵过程中始终存在。其中，Thermobifida fusca和热普通链霉菌在发酵过程中的数量变化近似一条钟形曲线，即发酵初期递增，发酵中后期逐渐降低，它们的动态变化非常符合一般堆料发酵中嗜热放线菌的菌群演替过程。特别是Thermob ifida fusca表现得尤为明显，顶峰时期（发酵中期）的菌群数量达到3.45×107/g堆料，约为发酵初期和后期的103～104倍，在所考察的3种菌中是优势菌群。作为秸秆腐熟剂常用的菌种，白浅灰链霉菌也体现出其在芦笋老茎堆料发酵中的价值，该菌不仅贯穿于整个发酵过程，而且数量一直稳定，只是是在发酵末期，数量稍微有所上升，达到2.40×105/g堆料。

目录

摘要

第一章 文献综述

1．1 芦笋和芦笋老茎的概况

1．1．1 芦笋

1．1．2 芦笋老茎

1．1．3 芦笋老茎作为农业废弃物的资源化利用情况

1．2 食用菌及其栽培

1．2．1 食用菌概述

1．2．2 食用菌栽培概述

1．2．3 鲍鱼菇概述

1．2．4 黄白侧耳概述

1．2．5 巴西蘑菇概述

1．3 适于蘑菇生长发育的堆肥及其堆制发酵概况

1．3．1 堆制

1．3．2 堆肥原料

1．3．3 堆制过程中的微生物

1．3．4 堆制过程中发酵菌剂的使用

1．4 堆料发酵过程中微生物多样性分析

1．4．1 基于生理生化技术的微生物多样性研究方法

1．4．2 核酸分子杂交技术

1．4．3 遗传指纹技术

1．4．4 核酸序列分析

1．5 实时荧光PCR的微生物定量测定

1．6 本研究的目的、意义及主要内容

参考文献

第二章 芦笋老茎栽培鲍鱼菇和黄白侧耳的初步研究

2．1 材料与方法

2．1．1 菌种

2．1．2 栽培原料与配方

2．1．3 栽培方法

2．1．4 多糖含量的测定

2．1．5 抗氧化性物质的提取

2．1．6 抗氧化性分析

2．2 结果

2．2．1 芦笋老茎培养料对鲍鱼菇和黄白侧耳产量的影响

2．2．2 芦笋老茎培养料对鲍鱼菇和黄白侧耳子实体多糖含量的影响

2．2．3 芦笋老茎培养料对鲍鱼菇和黄白侧耳子实体抗氧化性的影响

2．3 讨论

参考文献

第三章 芦笋老茎栽培巴西蘑菇的初步研究

3．1 材料与方法

3．1．1 菌株

3．1．2 培养料

3．1．3 栽培方法

3．1．4 样品处理

3．1．5 多糖含量的测定

3．1．6 抗氧化性物质的提取

3．1．7 抗氧化性分析

3．2 结果与分析

3．2．1 芦笋老茎培养料对巴西蘑菇产量的影响

3．2．2 芦笋老茎培养料对巴西蘑菇子实体多糖含量的影响

3．2．3 芦笋老茎培养料对巴西蘑菇子实体抗氧化性的影响

3．3 讨论

参考文献

第四章 芦笋老茎堆料中嗜热可培养微生物的初步研究

4．1 材料与方法

4．1．1 主要试剂

4．1．2 主要仪器

4．1．3 实验样品

4．1．4 培养基

4．1．5 菌株分离

4．1．6 细菌、放线茵菌株鉴定

4．2 结果

4．2．1 细菌、放线菌

4．2．2 真菌

4．3 讨论

参考文献

第五章 芦笋老茎堆料微生物总基因组DNA的提取

5．1 材料与方法

5．1．1 堆料

5．1．2 主要的工具酶和试剂

5．1．3 主要仪器

5．1．4 样品的采集、保存及前处理

5．1．5 总基因组DNA的提取

5．1．6 16S rDNA片段的扩增

5．2 结果

5．2．1 堆料微生物总基因组DNA的提取

5．2．2 基于微生物总基因组DNA的16S rDNA片段的扩增

5．3 讨论

5．4 小结

参考文献

第六章 芦笋老茎堆料细菌多样性研究

6．1 材料与方法

6．1．1 DNA模板

6．1．2 主要试剂

6．1．3 分析软件

6．1．4 细菌16S rDNA文库的构建

6．1．5 细菌16S rDNA序列测定

6．1．6 细菌16S rDNA多样性分析

6．1．7 细菌16S rDNA文库系统发育分析

6．1．8 核苷酸序列登录号

6．2 结果

6．2．1 细菌16S rDNA文库的构建

6．2．2 细菌16S rDNA文库的筛选

6．2．3 细菌16S rDNA多样性分析

6．2．4 细菌16S rDNA文库系统发育分析

6．2．5 细菌16S rDNA的GenBank收录

6．3 讨论

6．3．1 对芦笋老茎堆料样品16S rDNA文库构建过程的探讨

6．3．2 芦笋老茎堆料细菌16S rDNA文库系统学分析

6．4 小结

参考文献

第七章 芦笋老茎堆料部分微生物的实时荧光定量PCR分析

7．1 材料与方法

7．1．1 材料

7，1．2 主要试剂

7．1．3 主要仪器

7．1．4 引物设计

7．1．5 退火温度的选择

7．1．6 标准品制备及标准曲线的绘制

7．1．7 芦笋老茎堆料部分微生物的qRT-PCR

7．1．8 芦笋老茎堆料部分微生物的定量分析

7．2 结果

7．2．1 芦笋老茎堆料中Thermobifida fusca的qRT-PCR

7．2．2 芦笋老茎堆料中自浅灰链霉菌的qRT-PCR

7．2．3 芦笋老茎堆料中热普通链霉菌的qRT-PCR

7．3 讨论

7．4 小结

参考文献

第八章 全文总结与展望

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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