基于DNA条形码的分子生物学方法鉴定海参种类的研究

摘要

海参是我国传统的海洋食物和药物资源。近年来，随着对海参研究的不断深入，国内外学者发现海参具有提高机体免疫力、抗肿瘤、促进造血功能、抗凝血和降血脂等多种生理功效，海参及海参产品也因此得到越来越多的关注。海参胶囊、即食海参、海参口服液等产品的出现，丰富了海参产品的种类，进一步提升了海参的价值。传统的海参鉴定方法主要依据海参的外部形态和解剖特征，但这种方法不适用于加工后的海参的种类鉴定。因此建立快速、简便的海参种类鉴定方法，对于规范海参市场、保护消费者权益至关重要，对加快海参产业链的发展具有重要的意义。
　　 随着DNA条形码概念的提出，基于DNA条形码的分子生物学技术取得了快速发展，在种类鉴定领域发挥越来越重要的作用。本论文研究了海参线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(Mitochondrial cytochrome c oxidase subunitⅠ，COⅠ)基因作为DNA条形码用于海参种类鉴定的可行性。利用DNAstar6.1、DNAMAN6.0和MEGA4.1软件对海参线粒体COⅠ基因序列进行分析，计算不同海参的碱基组成，海参的种间遗传距离和种内遗传距离，分别利用邻接法和最大简约法构建了分子系统树。结果表明：海参的种间遗传距离显著大于种内遗传距离，同种海参不同个体在系统树中分别形成各自独立的分支，表明以COⅠ基因作为海参DNA条形码进行种类鉴定具有一定的可行性。
　　 在DNA条形码的基础上，建立了斑点杂交方法用于四种常见经济海参种类的鉴定。首先利用DNAStar6.1对加州拟刺参(Parastichopus californicus)，北大西洋瓜参(Cucumaria frondosa)，仿刺参(Apostichopus japonicas)及梅花参(Thelenota ananas)四种海参的线粒体COⅠ基因序列进行比对分析，然后采用Primer premier5.0软件设计四种海参的特异性探针，用于斑点杂交实验，结果显示，本实验设计的四条探针具有高度的特异性，灵敏度可达100ng，能够实现四种海参的准确鉴定。
　　 根据对四种海参线粒体COⅠ基因的比对结果，采用Primer premier5.0设计合成了四组特异性引物，建立了多重PCR方法用于四种海参种类的鉴定。仿刺参、梅花参、加州拟刺参和北大西洋瓜参的扩增片段长度分别为212bp、301bp、261bp和358bp，能够通过电泳得到区分。对多重PCR的特异性和灵敏度进行研究，结果表明，四组引物具有高度的特异性，灵敏度达到ng级；对不同海参的混合样品进行多重PCR鉴定，结果显示该方法能够同时检测混合样品中的所有海参种类。表明多重PCR方法是一种特异性强、灵敏度高、重复性好的海参种类鉴定方法。
　　 采用DNAMAN6.0对加州拟刺参(Parastichopus californicus)，北大西洋瓜参(Cucumaria frondosa)，仿刺参(Apostichopus japonicas)，梅花参(Thelenotaananas)及辐肛参(Actinopyga lecanora)线粒体COⅠ基因进行分析，建立酶切图谱，选择BamHⅠ，KpnⅠ，PstⅠ，XbaⅠ，Eco31Ⅰ用于五种海参的PCR-RFLP的分析。采用限制性内切酶对五种海参线粒体COⅠ基因进行酶切，酶切结果与分析结果吻合，没有非特异性酶切条带的出现。对不同海参的混合样品进行了鉴定，结果表明，本研究建立的PCR-RFLP方法能同时鉴定两种海参。说明建立的PCR-RFLP是一种简单、快速、可靠的海参种类鉴定方法。
　　 分别采用斑点杂交、多重PCR、PCR-RFLP方法对四种海参的不同加工样品进行鉴定，结果显示，本论文建立的三种方法中，多重PCR鉴定的准确率最高，达到了100％，PCR-RFLP方法其次，为87.5％，斑点杂交方法为75％。
　　 综上所述，本论文建立了三种分子生物学方法，可以用于海参种类的快速、准确鉴定，三种方法的建立，为构建海参鉴定体系，实现海参产品的种类鉴定，规范海参市场秩序，维护消费者权益具有重要的意义。