一氧化氮调控桃果实线粒体膜电压依赖型离子通道蛋白的分子机理

摘要

线粒体膜通透性转运孔(membrane permeability transition pore，MPTP)在线粒体介导的程序性死亡（mitochondria-mediated apoptosis）过程中起着重要作用。电压依赖型阴离子通道蛋白(voltage-dependent anion channel protein，VDAC protein)作为可以调节MPTP的重要因素，在植物体中的作用机理还不明确。一氧化氮（nitric oxide，NO）是一种可以介导植物多种生理功能与防御反应的非生物信号分子，参与植物果实的成熟与衰老过程并可调控线粒体功能，外源NO在延长果实贮藏期中有着良好的效果。因此，研究外源NO对VDAC蛋白的影响及其作用机理，有助于明确VDAC蛋白在采后果实成熟衰老中的作用，对于保持果实品质，延长贮藏期具有重要意义。
　　本实验第一部分是对肥城桃线粒体VDAC基因的克隆、VDAC蛋白的原核表达纯化及NO与VDAC蛋白互作，第二部分研究了NO处理后肥城桃线粒体性质变化以及相关酶活性的变化。
　　根据GenBank已公布的番茄等植物VDAC基因保守区设计兼并引物，通过RACE的方法，利用肥城桃果实总RNA克隆得到VDAC基因cDNA全长1225 bp，包含5个内含子接头区，VDAC基因编码区828 bp，编码276个氨基酸。构建VDAC-pET30a重组载体，通过大肠杆菌BL21(DE3)进行表达，利用镍柱进行纯化，得到纯化的重组VDAC蛋白。研究了NO与VDAC蛋白作用的荧光光谱，发现NO可使VDAC蛋白溶液荧光强度下降，发生荧光猝灭现象，该猝灭是一种静态猝灭。使用类似Scatchard模型分析得知，NO可以与VDAC蛋白形成1∶1的复合物。NO处理肥城桃的研究结果显示:在贮藏过程中，肥城桃果实线粒体的膜电势呈下降趋势，经NO处理的肥城桃线粒体的膜电势维持在相对较高的水平，其中经15μmol·L-1 NO处理桃果实的线粒体膜电势在贮藏过程中最高，其线粒体在离体实验中表现出对H2O2与Ca2+的高耐受力。桃果实线粒体己糖激酶Ⅱ的活性在贮藏过程中持续升高，经NO溶液处理的桃果实己糖激酶活性高于未处理及c-PTIO处理，其中经15μmol·L-1 NO处理桃果实的己糖激酶Ⅱ的活性上升的最快且峰值最高。桃果实线粒体中Ca2+的含量在贮藏初期急速下降，然后维持在相对稳定的水平，经NO处理的桃果实线粒体中Ca2+的含量较高。15μmol·L-1 NO处理显著上调了室温贮藏后期桃果实VDAC表达，而c-PTIO则下调了VDAC表达。说明外源NO处理能够维持线粒体膜电势，防止贮藏过程中线粒体膜电势的耗散，抑制线粒体中钙离子的外流，从而起到延缓桃果实细胞凋亡，延长肥城桃的贮藏期的作用。
　　本研究克隆得到肥城桃VDAC的cDNA全长，并表达纯化了VDAC蛋白。通过研究发现，外源NO可以通过调节肥城桃果实线粒体膜的通透性来延长肥城桃的贮藏期。