雏鸭感染坦布苏病毒后的排毒规律及病毒在血液、组织中含量变化的研究

摘要

2010年，曹贞贞、张大丙首次在我国报道了坦布苏病毒感染，该病最初被命名为鸭出血性卵巢炎(DHO)，随着对该病研究的深入，通过试验证明该病是由一种新型黄病毒引起的，即坦布苏病毒(Tembusu virus，TMUV)。坦布苏病毒感染自爆发以来，迅速波及福建、上海、江苏、浙江、山东等地区，该病的发生严重威胁着我国水禽业的发展，对我国养鸭业产生了巨大的经济损失。
　　目前，已经建立的坦布苏病毒的检测方法有很多，包括套式RT-PCR、LAMP、ELISA、地高辛、荧光定量RT-PCR等，其中荧光定量RT-PCR方法具有快捷、精确、敏感性高、重复性好等优点，在多个领域都有较广泛的应用。本研究利用荧光定量RT-PCR方法，旨在探索坦布苏病毒在樱桃谷雏鸭体内的排毒规律，明确病毒在血液及组织中含量的高峰期和变化趋势，同时记录病鸭发病情况，确定樱桃谷雏鸭感染坦布苏病毒后的潜伏期。为坦布苏病毒的预防和控制提供了理论依据。
　　本试验从疑似感染坦布苏病毒的病鸭体内分离到一株坦布苏病毒。将110只10日龄健康樱桃谷雏鸭分为3组，其中，静脉接种组70只，点眼滴鼻组及自然感染组各20只。经静脉、点眼滴鼻分别接种坦布苏病毒(TMUV) AHQY株，每只3.5 mL病毒尿囊液（3.11×10-3EID50/只），自然感染组不接种病毒，与静脉接种组混养。接种后，每隔2d采集泄殖腔棉拭子和血液，并随机剖杀3只，应用建立的荧光定量RT-PCR方法检测病毒的排毒规律及血液、组织中病毒载量的变化。
　　结果显示，分离的病毒经RT-PCR检测及克隆测序证明为坦布苏病毒。3个组的樱桃谷雏鸭感染坦布苏病毒的潜伏期均一致，平均为24 h，试验鸭在感染24 h后出现精神沉郁，采食量减少，排白绿色及棕色稀便的症状。樱桃谷雏鸭在接种病毒后的1～25 d均可排毒，静脉组及点眼滴鼻组在感染后5d出现排毒高峰，其次为11d和17d出现两个小排毒高峰，自然感染组出现高峰的时间比静脉及点眼滴鼻组晚2d。静脉接种组病毒在血液内的载量较其他两组明显低，高峰出现在感染后7d及19d，点眼滴鼻组高峰同静脉接种组一致，出现在感染后7d及19d，自然感染组血液中的病毒载量高峰出现在感染后9d及21 d。组织中坦布苏病毒载量较高的器官主要有脑、胸腺、法氏囊、胰腺、心脏，其次是脾脏、肝脏、肾脏，腺胃、气管、肺脏和肠道，病毒的相对表达量较少。接种病毒后的1-5 d，胸腺、脑、心脏中坦布苏病毒的载量自感染后持续升高至5d，之后降低，降低至第7d，然后又升高，并于感染后13d达到高峰。法氏囊、胰腺、肠道中病毒载量升高至感染后5d达到高峰而后逐渐降低。肝脏、肾脏、脾脏中病毒载量自感染后随天数的增加而逐渐升高，并于第13d达到高峰后降低。腺胃、气管、肺脏中的病毒载量自感染后随天数的增加而降低，持续至7d后升高，于第13d达到高峰后降低。研究表明，坦布苏病毒对樱桃谷雏鸭的感染能力较强，潜伏期短，病毒可通过泄殖腔向外界排毒，排毒时间较长，病毒随血液循环迅速侵入各组织器官。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 坦布苏病毒的一般生物学特征

1．1．1 坦布苏病毒的分类学地位

1．1．2 坦布苏病毒的形态结构

1．1．3 理化特性和培养特性

1．2 坦布苏病毒的分子生物学特征

1．2．1 坦布苏病毒与其他黄病毒属病毒的基因组同源性比较

1．2．2 黄病毒属病毒主要蛋白的研究进展

1．2．3 坦布苏病毒的流行病学研究

1．2．4 坦布苏病毒感染的临床症状及病理变化

1．3 坦布苏病毒诊断方法的研究

1．3．1 临床诊断

1．3．2 实验室诊断

1．3．3 坦布苏病毒分子生物学检测技术

1．4 坦布苏病毒感染的防制

1．4．1 生物安全措施

1．4．2 免疫预防

1．4．3 药物治疗

1．5 荧光定量检测方法的研究进展

1．5．1 实时荧光定量RT-PCR的基本原理

1．5．2 实时荧光定量PCR的基本概念

1．5．3 实时荧光定量的探针法

1．5．4 实时荧光定量的定量方法

1．5．5 实时荧光定量检测方法在临床生产中的应用

1．6 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 病毒与试验动物

2．1．2 主要试剂及化学药品

2．1．3 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 坦布苏病毒的分离鉴定

2．2．2 攻毒试验

3 结果与分析

3．1 坦布苏病毒分离鉴定结果

3．1．1 坦布苏病毒NS3基因RT-PCR扩增结果

3．1．2 TMUV NS3基因的克隆测序及序列分析

3．1．3 坦布苏病毒在鸭胚中的培养特性

3．1．4 坦布苏病毒分离株的毒力测定

3．2 樱桃谷雏鸭感染坦布苏病毒后的潜伏期

3．3 樱桃谷雏鸭感染坦布苏病毒后的排毒规律

3．4 樱桃谷雏鸭血液中坦布苏病毒载量的变化

3．5 樱桃谷雏鸭感染坦布苏病毒后各组织器官中病毒载量的变化

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

论文发表情况