不同遗传背景鸡群来源J亚群禽白血病病毒gp85的分子演变分析

摘要

J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup J，ALV-J)是1988年最早在英国的白羽肉鸡中发现和分离鉴定出来的。它主要引起髓细胞样细胞瘤。在1990's流行的早期，ALV-J仅在白羽肉鸡中发生自然感染。即使在人工接种时，ALV-J对蛋鸡的感染性和致肿瘤性也都显著低于对白羽肉鸡。在1990's，ALV-J随着进口白羽肉鸡传进了中国，最初只自然发生于白羽肉鸡。但从2000's初开始，ALV-J在中国也开始逐传入蛋用型鸡、黄羽肉鸡和固有的地方品种鸡，而且自然发病率越来越高。在有些鸡群，ALV-J感染鸡诱发肿瘤的严重性和多样性超过了当初在白羽肉鸡诱发的致病性。显然，ALV-J在中国不同遗传背景的鸡群中流行病学特点发生了显著变化。这一变化是否与过去二十多年中ALV-J发生了重大演变相关？如果是，又是什么样的演变导致ALV-J适应不同遗传背景的鸡群？本学位论文试图利用现代分子病毒学的比较方法，探索ALV-J最容易发生变异的囊膜蛋白gp85的演变及LTR与适应不同类型鸡群的相关性，并探索其对其它非鸡禽类的致病性。
　　1.不同遗传背景鸡群来源的ALV-J的囊膜蛋白gp85的同源性比较
　　分别比较了分离自具有不同遗传背景鸡群的150株ALV-J的囊膜蛋白gp85在氨基酸水平的同源性关系。这些毒株包括:1988年首先从英国白羽肉鸡分离到的ALV-J原型株HPRS103和1990's初从美国白羽肉鸡分离到的8株ALV-J;1999年-2008年期间从中国白羽肉鸡分离到的22株ALV-J;2005年以来从中国黄羽肉鸡（用白羽肉鸡与中国不同固有地方品种杂交的改良品种）42株ALV-J;2007年以来从中国蛋用型鸡分离到的51株ALV-J;从中国历史上长期自然形成的地方品种鸡分离到的26株ALV-J。
　　2.ALV-J的gp85基因随着年份的变异趋势
　　鉴于本实验室已连续收集了近14年的大量流行毒株，我们有条件来进一步分析ALV-J gp85的变异趋势。不同年份分离到的流行毒株与原型株HPRS-103株的gp85同源性比较表明，1990's、2000、2001、2002、2003、2005、2006、2007、2008、2009、2010、2012、2013年分离的ALV-J gp85同HPRS-103的gp85相比同源性分别为86.6％-95.5％、89.9％-92.5％、90.3％-92.2％、89.9％-92.2％、90.6％-95.8％、89.9％-91.9％、89.2％-91.2％、88.3％-92.9％、89.9％-96.7％、87.9％-96.4％、87.9％-93.8％、87.0％-92.5％和86.8％-92.1％，显示新分离的ALV-J流行株的gp85并没有越来越偏离原型株HPRS-103。同时选择最新分离到的与HPRS-103同源性最低和最高的两毒株2-LH5-15(86.8％)和JS13-LY1-5(92.1％)分别同其他不同时间分离到的毒株做gp85同源性比较，2-LH5-15与上述年份分离株同源性范围分别为87.7％-91.4％、87.4％-89.4％、86.4％-91.4％、87.1％-88.1％、86.8％-83.1％、90.4％-91.7％、89.7％-93％、88％-92.7％、87％-92.4％、87.4％-93％、88.7％-92.1％、87.7％-91.4％和85.7％-94.4％; JS13-LY1-5与上述年份分离株同源性范围分别为87.1％-93.7％、91.7％-93.1％、89.8％-92.4％、91.1％-91.7％、89.4％-92.4％、90.4％-92.4％、91.1％-92.7％、90％-94.1％、91.4％-93.4％、90.4％-94.4％、89.7％-91.4％、88.2％-93.4％和88.4％-100％。三种比较方法回归方程显示，同源性程度与分离时间不相关，即流行株与原型株HPRS-103及最新分离到的毒株的偏离度与分离年份的远近无关。根据同源性程度分析，新的分离株更倾向于随着年份是以HPRS-103为原点向不同方向在一定限度内随机变异，迄今为止与HPRS-103最大变异株的同源性低至86.6％，为1997年从美国白羽肉鸡分到的6827毒株。
　　3.不同来源ALV-J在来航蛋鸡和白羽肉鸡连续传代过程中病毒准种组成的变异趋势
　　为了深入探索ALV-J在不同遗传背景鸡群致病性增强的适应过程中变异的分子机制，本研究将2001年从白羽肉鸡分离到的ALV-JNX0101株和2012年从蛋鸡分离到的ALV-J733株分别在来航鸡（现代蛋用型鸡的原始品种）和白羽肉鸡人工接种连续传代，以此来判定不同毒株在不同遗传背景鸡的感染过程中是否存在着变异和适应变化。鉴于这种改变是一个渐进过程，为发现微小的变异，本研究采用了现代高通量测序技术分别对不同传代鸡血浆中ALV-J的病毒粒子基因组RNA的gp85基因和LTR的RT-PCR产物测序。利用这一技术，对每只鸡每一次血浆样品都可以获得1万条以上有效序列。
　　3.1.蛋鸡来源的ALV-J733株在蛋鸡与肉鸡传代过程中的优势准种组成的比较
　　对大数据的比较分析表明，当将来源于蛋鸡的ALV-J733株在来航蛋鸡连续传代时，不仅最优势变异种（或分子变异株，molecular variants）没有发生变化，而且前几十位的次优势变异种组成也没有发生明显变化。当将同一毒株人工接种白羽肉鸡传代过程中，在传至3-5代后，虽然gp85的优势变异种没有变化，但有三只鸡中在前60位的次优势变异种中，共同出现了28个排名上升的变异种，其中有些在最初接种物中比例很低，而在来航鸡传代的三只鸡，只出现了4个新的次优势变异种。这表明，蛋鸡来源的ALV-J733株在来航鸡的传代过程中，其准种组成没有发生选择性变异，但是在白羽肉鸡传代过程中，在不同遗传背景鸡体的复制环境的选择压作用下，其优势准种的组成开始发生变异。
　　3.2.白羽肉鸡来源的ALV-JNX0101株在蛋鸡和肉鸡传代过程中的优势准种组成变异的比较
　　当将来源于肉鸡的ALV-J NX0101株在来航蛋鸡连续传代时，gp85最优势变异种有多个分组发生了更替，其中gp85-A组中有3个、gp85-B组中有2个发生了最优势变异种的变化，但gp85-B组新出现的优势变异种仅限于相对于原始毒的前5位变异种。当将NX0101株ALV-J在白羽肉鸡连续传代时，gp85-A最优势变异种发生明显的变化，传至3代时，甚至有原始毒中排名第128位的变异种成为最优势变异种;而gp85-B最优势变异种虽发生变化，但新出现的优势变异种仅限于相对于原始毒的前3位变异种。ALV-J NX0101株在来航蛋鸡和白羽肉鸡传代时，gp85-A最优势变异种变化明显，而gp85-B优势变异种组成则相对稳定。在前60位变异种的次优势变异种中，蛋鸡组和肉鸡组排名共同上升的变异种数量无明显差异，但肉鸡的生态环境选择压对ALV-JNX0101准种的组成结构影响较蛋鸡更大。
　　4.ALV-J对不同种鸟类的致病性
　　本研究将ALV-J733株经卵黄囊接种相应鸟的胚胎及幼雏，经过多次检测，均未从1-6周龄的山鸡和鹌鹑血浆中分离检测到ALV-J群特异性抗原p27。但是在7月龄时，胚胎接种山鸡表现出肿瘤症状，且能从肿瘤病变组织中分离到的ALV-J与攻毒所用ALV-J733株高度同源。这一结果表明，ALV-J能感染山鸡并产生肿瘤，但需要较长时间。ALV-J毒株未能获得在鹌鹑的易感性。

目录

声明

论文说明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 禽白血病病毒研究进展

1．1．1 概述

1．1．2 分类

1．1．3 不同亚群及新的亚群的鉴定

1．1．4 内源性ALV和外源性ALV

1．1．5 病毒粒子与基因组结构

1．1．6 感染宿主的广泛性

1．1．7 病毒传播方式

1．1．8 ALV诱发肿瘤的机制及类型

1．1．9 ALV的检测与诊断

1．1．10 ALV的预防和控制

1．1．11 国内外鸡群中ALV流行动态及演变趋势

1．2 ALV-J在我国不同鸡群中的流行及分子变异

1．2．1 我国鸡群中ALV-J感染发生发展的历史

1．2．2 我国鸡群ALV-J诱发肿瘤的多样性及特点

1．2．3 ALV-J在我国感染和适应不同遗传背景鸡群中的分子变异

1．3 动物病毒的准种及其演变

1．3．1 准种的概念与基本特性

1．3．2 病毒准种在不同选择压力下的演变

1．3．3 病毒准种的研究方法

1．4 本研究的目的和意义

2 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 细胞与毒株

2．1．2 菌种和载体

2．1．3 主要试剂及试剂盒

2．1．4 试验动物

2．1．5 主要配制试剂

2．1．6 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 不同遗传背景来源鸡群ALV-J分离株gp85基因序列比较

2．2．2 两株ALV-J分别在蛋鸡和肉鸡连续传代过程中准种演变趋势的测定

2．3 山鸡和鹌鹑对ALV-J NX0101株和733株易感性测定

2．3．1 山鸡胚和鹌鹑胚接种ALV-J NX0101株和733株后病毒血症的检测

2．3．2 山鸡雏和鹌鹑雏接种ALV-J NX0101株和ALV-J 733株后病毒血症的检测

2．3．3 病理切片的制备

2．3．4 肿瘤组织中ALV-J的分离鉴定

3 结果与分析

3．1 ALV-J gp85在不同遗传背景鸡的分子演化分析

3．1．1 不同遗传背景鸡ALV-J分离株gp85氨基酸的同源性比较

3．1．2 不同年份ALV-J分离株gp85氨基酸的同源性比较

3．1．3 不同遗传背景鸡来源ALV-J分离株gp85氨基酸的进化树分析

3．2 ALV-J 733毒株在不同遗传背景鸡连续传代过程中的准种演变

3．2．1 ALV-J 733毒株在不同遗传背景鸡内连续传代过程中样品的编号与选择

3．2．2 ALV-J 733毒株在不同遗传背景鸡内连续传代过程中病毒复制能力比较

3．2．3 长片段ENV+LTR的常规测序

3．2．5 高通量测序显示ALV-J 733病毒在不同遗传背景鸡连续传代过程中的准种演变

3．3 ALV-J NX0101毒株在不同遗传背景鸡连续传代过程中的准种演变

3．3．1 ALV-J NX0101毒株在不同遗传背景鸡连续传代过程中样品的编号与选择

3．3．2 ALV-J NX0101毒株在不同遗传背景鸡连续传代过程中病毒复制能力比较

3．3．3 长片段ENV+LTR的常规测序

3．3．4 常规测序显示ALV-J NX0101病毒在不同遗传背景鸡连续传代过程中的准种演变

3．3．5 高通量测序显示NX0101毒株在不同遗传背景鸡内连续传代过程中的准种演变

3．3．6 ALV-J NX0101毒株在不同代次不同片段变异种排名的上升情况

3．3．7 ALV-J NX0101毒株gp85-A段共同上升的变异种比较

3．3．9 ALV-J NX0101毒株在不同遗传背景鸡群中的准种演化

3．4 山鸡和鹌鹑对ALV-J NX0101株和733株易感性的测定

3．4．1 胚胎期接种ALV-J后山鸡和鹌鹑血浆中病毒血症的检测结果

3．4．2 山鸡雏和鹌鹁雏接种ALV-J后病毒血症检测结果

3．4．3 1-6周龄山鸡和鹌鹑血浆中病毒DNA分子斑点杂交的鉴定结果

3．4．4 7月龄山鸡症状的观察及病原分离鉴定

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

8 攻读学位期间发表论文情况