J亚群禽白血病病毒与禽网状内皮组织增生症病毒Exosome途径协同感染机制

摘要

近年来，J亚群禽白血病病毒（ALV-J）和禽网状内皮组织增生症病毒（REV）共同感染和协同致病的现象广泛发生，给我国养禽业带来了严重的损失，然而，关于ALV-J和REV协同感染的机制尚不明了。Exosome是由细胞分泌的一种功能性小囊泡，它通过调节特异性蛋白质、脂质、核酸等的分泌，参与体内多种的生理和病理过程。Exosome为我们研究ALV-J与REV协同感染机制提供了新思路。
　　本研究在证明ALV-J和REV具有协同感染能力的基础上，拟通过分析共感染ALV-J+REV细胞分泌的exosome的蛋白质组学和转录组学(miRNA)，揭示ALV-J和REV共同利用的细胞通路，从而初步阐明ALV-J与REV协同感染机制，为联合防控及其它病毒间协同感染机制研究奠定科学基础。
　　将ALV-J-NX0101病毒和REV-SNV株病毒接种无特定病原体（SPF）鸡胚分离的鸡胚成纤维细胞，设置4个实验组：ALV-J+REV组，ALV-J组，REV组，和无病毒空白对照组。经PCR、间接免疫荧光（IFA）和禽白血病抗原（p27）检测接毒成功后，以荧光定量PCR方法从病毒转录层面证明ALV-J和REV协同感染，结果显示在感染72h内，共同感染组中ALV-J和REV的RNA转录水平均高于单独感染组；通过激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)观察发现，ALV-J和REV共同感染组REV蛋白表达较单独感染组提前24h，ALV-J的蛋白表达较单独感染组增强，从蛋白层面证明了ALV-J和REV具有协同感染作用。
　　为研究ALV-J和REV共感染细胞分泌的exosome在免疫抑制上是否也具有协同作用，我们无菌分离42日龄SPF鸡脾白细胞，加入定量的Exosomes共同培养一定时间，通过流式细胞术检测CD4+、CD8+T细胞数量，ELISA实验检测IL-2、IL-10、IL-12的分泌情况。结果显示，12h之前，Exo-RJ组CD4+和CD8+T细胞的数量均低于对照组；IL-2的分泌量在4h，Exo-RJ组高于对照组，且与Exo-R组差异显著；IL-10的分泌量在8h，Exo-RJ均显著低于对照组；IL-12的分泌量在0.5h，Exo-RJ均低于对照组，且差异显著。这说明共感染ALV-J和REV细胞分泌的exosomes对免疫细胞抑制作用增强。
　　为揭示ALV-J和REV是否共同利用细胞信号通路达到协同作用，我们对提取到的exosome进行iTRAQ蛋白质组学分析，同时用相同的exosome样品提取RNA进行Hiseq miRNA分析。结果显示，在CEF细胞培养上清液提取的exosome中共鉴定了1154种蛋白质，932种已知miRNA和785种未知miRNA。四组exosomes中均存在exosome的标志性蛋白质，如Hsp70、Hsp90、四跨膜蛋白、14-3-3等，而且我们exosome中检测到了ALV-J的gag、env蛋白质以及REV的gag、pol和env蛋白质，这说明病毒感染细胞分泌的exosome中携带了病毒结构蛋白。通过对表达差异蛋白的靶标蛋白、差异miRNA靶标蛋白的聚类及信号通路分析，发现差异蛋白NCKAP1与差异miRNA靶蛋白ITGA1位于共同的肌动蛋白细胞骨架（Regulation of actin cytoskeleton）信号通路上，使ARP2/3蛋白下调，抑制肌动蛋白聚合及板状伪足形成，说明ALV-J和REV从蛋白质水平和miRNA水平共同启动了肌动蛋白细胞骨架通路，从而形成协同作用。肌动蛋白细胞骨架，是纤维状肌动蛋白在细胞中的分布网络，它具有维持细胞形状、调控细胞粘连及细胞运动等功能。实验证明该通路的异常改变会引起包括肿瘤在内的多种疾病的发生，并且有许多癌症的预防、治疗药物是通过改变肌动蛋白细胞骨架结构来实现的。
　　我们对ALV-J和REV协同启动肌动蛋白细胞骨架通路的发现，不仅对研究ALV-J与REV协同机制意义重大，更将为禽肿瘤病或其它禽病研究提供科学的理论依据，为预防和治疗禽肿瘤病提供新的思路，但对这一通路还有待于进一步验证。