‘泰山早霞’苹果(Malus domestica Borkh.)果实成熟软化相关基因的分离与功能鉴定

摘要

我国是世界上最大的苹果生产大国，70％以上为晚熟‘富士’，早熟品种所占比例过小，品种结构亟待改善，而生产中缺乏优质早熟苹果品种成为品种结构改善的瓶颈问题。课题组选育的早熟苹果品种‘泰山早霞’，成熟早、外观美、品质优，综合经济性状优良，但依然存在果实成熟后易软化变绵这一早熟苹果的共性问题。因此，进一步研究‘泰山早霞’苹果果实成熟软化机理，不仅对‘泰山早霞’果实品质调控及品种推广应用具有重要意义，而且有助于丰富苹果果实品质形成理论体系，为遗传育种和品种改良提供科学的理论依据。本文在优化建立质构仪评价果实质地品质方法的基础上，进一步以‘泰山早霞’苹果为试材，构建了两个抑制性差减杂交文库，分离到果实成熟软化相关基因，并测定发育期果实硬度、乙烯释放量、成熟软化相关酶活性和基因表达量变化以及1-MCP处理对各指标的影响。克隆了4个细胞壁代谢基因并在番茄中过量表达，探究其对乙烯生物合成、信号转导及果实软化相关基因的影响。主要研究结果如下：
　　1.研究明确了 P/2探头带果皮穿刺、测试速度1 mm·s-1及穿刺深度10 mm是利用质构仪评价苹果果实质地品质的最佳条件。
　　2.以花后60 d和70 d的‘泰山早霞’苹果果实样品为材料，构建了抑制性差减杂交正反文库，分离得到648个与果实成熟软化相关的差异表达基因，其中涉及细胞壁修饰、花青苷合成、香气合成、胁迫响应、代谢、转运、转录以及未注释功能等途径的87个基因与果实成熟软化密切相关。qRT-PCR验证和相关性分析表明，‘泰山早霞’苹果果实质地发育、花青苷及香气合成均受乙烯调控。
　　3.鉴定发现‘泰山早霞’苹果 ACS1基因型为 ACS1-1/-1纯合子，而‘富士’和‘金帅’分别为ACS1-2/-2纯合子和ACS1-1/-2杂合子，ACS1-2启动子区反转录转座子的插入导致其转录活性和乙烯释放量大大降低。‘泰山早霞’苹果 ACS1、ACO1的高转录活性可能是其果实发育后期乙烯释放高峰出现的主要原因。
　　4.‘泰山早霞’苹果果实软化是乙烯调控的PG、β-Gal、β-Glu、XTH2、XTH10和AM等多基因协同作用的结果。
　　（1）1-MCP通过抑制‘泰山早霞’苹果乙烯生物合成和信号转导基因（ACS1、ACO1、ERF2）以及果实软化相关基因（β-Gal、β-Glu、XTH2和 XTH10）的表达水平延缓果实成熟软化过程。
　　（2）番茄中过量表达β-Gal、β-Glu、XTH2和XTH10均能引起PG等果实软化基因以及乙烯生物合成和信号转导基因（ACS1、ACO1和ERF2）的上调表达。

目录

声明

符号说明

1前言

1.1乙烯生物合成及调节机制

1.2乙烯生物合成与果实成熟软化

1.2乙烯的信号转导途径

1.3细胞壁代谢与果实成熟软化

1.4抑制性差减杂交技术（SSH）研究进展

1.5研究的目的和意义

1.6研究的主要内容

2材料与方法

2.1试验材料

2.2实验方法

3结果与分析

3.1质构仪评价苹果果实质地品质的方法优化

3.2‘泰山早霞’苹果果实抑制性差减杂交文库的构建及差异基因的分离

3.3‘泰山早霞’苹果ACS1基因型鉴定及乙烯生物合成基因表达分析

3.4‘泰山早霞’苹果果实成熟软化关键基因的筛选

3.5‘泰山早霞’苹果果实软化关键基因及启动子的克隆分析

3.6番茄转基因功能验证

4讨论

4.1 ‘泰山早霞’苹果SSH文库的构建及成熟相关基因的挖掘

4.2 ACS1基因型与果实成熟软化

5结论

参考文献

攻读学位期间发表论文情况及发明专利

致谢

附录