过表达SlJA2通过水杨酸途径降低转基因烟草的高温抗性

摘要

随着全球变暖日益加剧的影响，高温胁迫已经成为限制植物分布和产量的重要因素。高温胁迫影响植物的一系列生理和生化反应，包括气孔关闭，水分散失，光合作用的抑制，活性氧积累，增加膜脂质过氧化程度，蛋白质降解和酶活性丧失，最终导致严重的细胞损伤，甚至细胞死亡。番茄是喜温蔬菜，但不耐高温，夏秋季局部地区出现的异常高温严重抑制番茄的生长发育，如何缓解高温胁迫已成为当务之急。因此，探讨番茄耐高温机理及其分子机制，具有重要的理论意义和实践价值。
　　NAC转录因子是植物特有的也是最大的转录因子家族之一，在调控植物生长发育及响应逆境胁迫和激素应答中均发挥重要作用。通过生物信息学对番茄基因组进行分析，从番茄中分离得到约102个NAC转录因子，但其中大部分的功能尚未得到研究。本研究从番茄基因组中分离得到了一个 NAC转录因子（SlJA2），并以过表达 SlJA2的转基因烟草为材料，观察了高温胁迫下植株的生长状况，研究了SlJA2对烟草高温抗性的影响。主要研究结果如下：
　　（1）根据NCBI已知的SlJA2基因序列（注册号：NM_001247043）利用DNAMAN6.0设计特异引物，以番茄cDNA为模板，利用PCR反应获得该基因的全长cDNA。SlJA2基因全长1567bp，开放阅读框1050bp，编码349个氨基酸。
　　（2）在烟草中瞬时表达 p1300-SlJA2-GFP融合蛋白产物，并利用激光共聚焦显微镜进行观察，发现绿色荧光只存在于细胞核中，说明SlJA2定位于细胞核；利用酵母双杂交系统检测SlJA2的转录激活活性，发现其C端具有转录激活活性，是转录激活区，说明SlJA2可能作为转录因子行使功能。
　　（3）通过实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）对 SlJA2在番茄中的表达模式进行分析，发现该基因表达受4℃、42℃、ABA、SA、PEG和MV等多种胁迫和激素处理的诱导表达；组织特异性表达分析和 GUS组织化学分析结果表明 SlJA2基因在叶及茎中表达量最高。
　　（4）构建pBI121-SlJA2真核表达载体，利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草，获得过表达SlJA2的转基因烟草，利用PCR、qRT-PCR筛选得到转基因烟草，并选取OE-5、OE-7和OE-18三个转基因株系进行后续实验。
　　（5）室温条件下，野生型烟草与转基因烟草生长状况没有明显差别。高温胁迫后，野生型烟草和转基因烟草的生长都受到抑制，但是转基因植株要比野生型烟草萎蔫的更加严重；转基因烟草具有更低的种子萌发率及鲜重、较高的气孔开度和水分散失率，导致更严重的萎蔫。高温胁迫下转基因烟草水杨酸的含量下降，水杨酸合成基因下调而降解基因上调；转基因烟草脱落酸的含量上调，脱落酸合成相关基因表达量上调。外源施加水杨酸和脱落酸都能延迟和缓解转基因烟草高温胁迫下的萎蔫。
　　（6）高温胁迫后，烟草植株的Pn、Fv/Fm和D1蛋白的水平降低，并且转基因植株降低的幅度要比野生型烟草的大；同时烟草植株叶绿素含量降低，并且转基因烟草的叶绿素含量更低。
　　（7）高温胁迫下，烟草的 H2O2和 O2??的含量明显增加，转基因烟草 H2O2和 O2??的积累高于野生型烟草，烟草植株抗氧化酶如过氧化氢酶（CAT）以及抗坏血酸过氧化物酶（APX）的活性都降低，但是与转基因植株相比，野生型烟草植株维持相对较高的抗氧化酶活性。同时，对抗氧化酶合成相关基因（NtCAT、NtAPX）的表达量进行检测显示，转基因植物中的抗氧化酶基因的表达量低于野生型植株。高温胁迫下转基因烟草的MDA含量和REL水平明显高于野生型，说明其细胞膜受伤害程度较重；高温胁迫下，转基因烟草中高温响应基因和脯氨酸合成基因等胁迫响应相关基因上调程度明显低于野生型。同时，转基因烟草中脯氨酸、可溶性糖等渗透调节物质含量增加，但增加量明显低于野生型。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1 NAC转录因子研究进展

1.2 高温胁迫对植物的影响

1.3 SA参与高温胁迫的调控

1.4 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 番茄SlJA2基因的分离及序列特征

3.2 SlJA2蛋白的亚细胞定位

3.3 SlJA2蛋白转录激活活性的验证

3.4 SlJA2组织表达模式的分析

3.5 胁迫处理下SlJA2表达模式的分析

3.6 SlJA2在烟草中的遗传转化

3.7 过表达SlJA2对转基因烟草的高温抗性的影响

3.8 过表达SlJA2对烟草体内相关激素含量的影响

3.9 过表达SlJA2对烟草光合参数的影响

3.10 过表达SlJA2对烟草体内活性氧的影响

3.11 过表达SlJA2对烟草细胞膜的影响

3.12 过表达SlJA2降低了高温胁迫相关基因的表达

4 讨论

4.1 SlJA2是典型的NAC转录因子

4.2 SlJA2基因的表达模式

4.3 过表达SlJA2降低了转基因烟草的高温抗性

4.4 SlJA2可能通过SA途径调控高温下的气孔运动

4.5 SlJA2可能参与的高温调控通路

5 结论

参考文献

致谢

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