GeXP多重PCR技术鉴别多个鹿种的方法研究

摘要

鹿类动物在古代典籍《神农本草经》和《本草纲目》中曾被记载其温肾壮阳、益精补血之功效。随着2000年将梅花鹿和马鹿列入《中华人民共和国药典》（一部）正品药材，以梅花鹿马鹿为主的高值鹿类产品的开发及应用逐渐增多，如鹿茸、鹿鞭等高值药材。然而随之而来国内外各类鹿产品的真假难辨和参差不齐等问题，对消费者的经济、安全、及特殊的宗教信仰造成干扰和威胁。为了打击高值鹿产品的商业欺诈行为，同时为了防止少数野生珍稀鹿类动物如白唇鹿等资源遭受非法捕杀和利用，建立科学、特异、准确、高通量的鹿种间鉴别方法十分必要。
　　针对上述鉴别需求，本研究基于GeXP多重PCR技术建立了可区分梅花鹿、马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿等6种鹿类动物的种间区分体系，主要研究工作和结果如下：
　　1.参考DNAMAN对各鹿种线粒体D-loop、cytb、16S rRNA基因组的碱基序列比对结果设计和筛选了梅花鹿和马鹿、马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿等6鹿种共150余对引物对，并成功确定了可特异区分6鹿种的特异性靶基因，扩增产物片段长度分别为马鹿283 bp，驯鹿为107 bp，麋鹿为157 bp，黇鹿为167 bp，白唇鹿为187bp，马鹿/梅花鹿316bp，经单重PCR结合琼脂糖凝胶电泳和GeXP片段分析试验证明所设计引物均仅对各自鹿种有效，能特异准确地扩增相应鹿种。
　　2.采用单因素分析法依次对GeXP多重PCR体系中3类DNA聚合酶、6组不同引物退火温度和3组不同引物浓度比进行了优化，对各引物对验证其交叉特异性，通过多次调整反复试验确定了适应本研究所建方法的各项理想参数，建立了特异灵敏、清晰分辨的检测体系。
　　3.建立了用于马鹿产品鉴伪的马鹿、麋鹿、驯鹿、黇鹿GeXP四重PCR体系、和包含国家二类保护动物白唇鹿在内的马鹿、麋鹿、驯鹿、黇鹿、白唇鹿的GeXP五重PCR体系；建立了梅花鹿和马鹿产品的鉴伪GeXP六重PCR体系，该体系可以准确鉴定马鹿、麋鹿、驯鹿、黇鹿、白唇鹿，以及无马鹿成分条件下的梅花鹿成分，仅对梅花鹿马鹿混合品无法区分。
　　4.以本实验所建立GeXP多重PCR方法对包含12份市售采集样品和4份本实验室收集样品共16份实际样品进行检测，检测结果相应特征峰清晰。表明该方法灵敏
　　5.特异，可对鹿类动物种间区分、特定鹿种成分、以及鹿类产品中鹿源性成分实行有效可靠的鉴定。
　　目前国内外能一次实验实现多种鹿类动物鉴别的研究十分少数，多重PCR技术领域尚未实现4重以上鹿种鉴别研究，而运用GeXP多重PCR技术进行鹿种区分的研究还未见报道，因此本研究基于GeXP多重PCR技术开展鹿类动物种间鉴别的方法研究具有重要的开创性和突破性意义。

目录

声明

符 号 说 明

1 引 言

1.1 鹿种鉴别的意义

1.2 种间鉴别方法研究进展

1.3 多重PCR技术研究进展

1.4 GeXP多重PCR技术研究进展

1.5 本研究目的及意义

2 材料及方法

2.1实验材料

2.2 主要试剂

2.3 主要仪器设备

2.4 实验方法

3 结果与分析

3.1 引物设计

3.2 单重PCR验证引物特异性电泳图

3.3 GeXP单重PCR验证引物特异性

3.4 马鹿产品鉴伪的GeXP多重 PCR体系

3.5 梅花鹿和马鹿产品的鉴伪GeXP六重 PCR体系

3.6 实际样品检测

4 讨论

4.1 靶序列的选择与引物设计

4.2 GeXP多重PCR体系优化

4.3 GeXP多重PCR技术应用于鹿类种间鉴定的适用性

4.4 进一步研究方向

5 结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文情况