同时检测四种不同NA亚型H5禽流感病毒GeXP多重PCR方法的建立

摘要

禽流感是由禽流感病毒引起的一种禽类急性传染病,同时某些亚型禽流感病毒也能感染人类.禽流感病毒根据其表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原关系差异,可将其分为16种HA亚型和9种NA亚型.根据其致病性可分为高致病性禽流感和低致病性禽流感,高致病性禽流感包括H5和H7亚型.特别是近年来频繁爆发的H5亚型禽流感疫情给许多国家和地区的养禽业造成了巨大的经济损失.2003年以来,H5N1亚型禽流感病毒疫情已经从亚洲逐步蔓延至欧洲以及非洲在内的共计56个国家和地区.2014以来，中国的黑龙江、江苏和湖南等省先后发生家禽感染H5N6亚型禽流感病毒的疫情，韩国、日本、荷兰、英国、德国、美国和中国台湾等地区相继出现H5N8禽流感疫情，还有2015年在美国爆发的H5N2亚型禽流感疫情，上述疫情均造成大量家禽死亡和被扑杀。此外，H5NI亚型和H5N6亚型AIV可以直接感染人并引起死亡的事件提示H5亚型AIV不仅给养禽业造成巨大经济损失，还可以跨越宿主种属屏障直接感染人进而危及人类安全。rn 目前检测H5亚型AIV的核酸检测方法多是针对其HA基因，同时检测H5、Nl、N2、N6和N8基因并进行分型的技术尚未见有报道。本研究利用GenomeLab(tm) GeXP遗传分析系统建立了一种能同时检测M、H5、N1、N2、N6和N8 6个基因的禽流感病毒多重逆转录-聚合酶链反应(mRT-PCR)方法。首先对反应条件和多重反应体系进行优化，然后分别用已验证的阳性模板对多重PCR体系进行特异性验证。多重检测体系可以同时检测出H5亚型禽流感病毒4种不同NA亚型，灵敏度为102拷贝/μL。本研究建立的GeXP多重PCR技术能够同时对H5亚型禽流感病毒的四种不同NA亚型进行检测和分型，达到快速鉴别目前对养禽业危害最大的H5NI、H5N2、H5N6和H5N8四种组合禽流感病毒的目的。该方法具有高通量、特异性强、灵敏度高且快速等优点，对H5亚型禽流感病毒的流行病学调查及其鉴别诊断具有重要意义。