miR-331-3p对猪前体脂肪细胞增殖、分化与脂肪酸积累的调控

摘要

miRNAs是在真核生物中被发现的一类内源性的单链非编码小RNA，其长度18-25nt左右，miRNA在不同物种间具有严格的保守性，具有调控基因转录后翻译的作用，能够参与多种生命活动，包括有机体的发育过程，机体的免疫过程，甚至能够参与到肿瘤癌症的发生和成熟脂肪细胞的形成等过程。成熟脂肪细胞的形成是一个极其复杂的生物过程，涉及到诸多因素的调控作用。成熟脂肪细胞的形成过程主要包括三个主要的阶段，包括间充质干细胞形成前体脂肪细胞，前体脂肪细胞生长增殖以及前体脂肪细胞分化成为成熟脂肪细胞，这其中后两个阶段是成熟脂肪细胞形成的重要部分。 本研究通过转录组测序的结果以及阅读相关的文献，选取了差异表达的miR-331-3p进行更深入研究。并通过相关实验证明了miR-331-3p参与到猪的前体脂肪细胞增殖、分化与脂肪酸代谢过程中。 主要研究结果如下： 1、过表达miR-331-3p后，通过CCK8试剂分析细胞生长状况检测，发现细胞生长速度减慢，并且流式细胞术分析的结果处于G0/G1期细胞比例上升，S期细胞比例下降也与CCK8实验结果相符合。过表达miR-331-3p后，利用qRT-PCR检测了细胞周期相关基因，发现促进细胞增殖相关的基因mRNA水平均显著降低，而抑制细胞增殖的相关基因的mRNA水平显著升高。结果表明miR-331-3p具有抑制猪前体脂肪细胞增殖的调控作用。 2、过表达miR-331-3p后，将前体脂肪细胞诱导分化并通过qRT-PCR的方法检测miR-331-3p在前体脂肪细胞分化过程中的表达趋势以及检测其分化过程中前体脂肪细胞分化标志基因PPARγ的表达变化，发现miR-331-3p具有促进前体脂肪细胞分化的作用。 3、利用生物信息学的方法预测到了和脂肪酸代谢相关的基因DLST和SLC25A1基因，通过双荧光素酶报告系统荧光素酶表达量的变化验证了DLST为miR-331-3p的靶基因，并且过表达miR-331-3p能够显著降低DLST mRNA水平和蛋白水平的表达。DLST基因编码的酶存在于柠檬酸丙酮酸循环通路中，这条通路能够将细胞合成脂肪酸的所必需的乙酰-COA从线粒体中转运到细胞质中。根据DLST、SLC25A1基因以及其通路上下游基因特别是其中ACLY和FAS基因的荧光定量结果，过表达miR-331-3p后脂肪酸合成增加。油红O染色以及脂滴的定量均表明过表达miR-331-3p后脂肪酸合成增加，转染inhibitor效果均相反，也证明了miR-331-3p可以通过柠檬酸丙酮酸循环通路促进脂肪酸的合成。 综上所述，本研究系统的分析了miR-331-3p对于前体脂肪细胞增殖分化与脂肪酸累积的调控，最终证明了miR-331-3p能够抑制前体脂肪细胞增殖，促进其分化成为成熟脂肪细胞以及能够促进脂肪酸积累。

目录

声明

英文缩略图表

1 前 言

1.1 研究背景

1.2 肌内脂肪沉积的遗传机理

1.3 miRNA的研究进展

1.4 miR-331-3p的研究进展

1.5 脂肪酸的合成

1.6本试验研究的目的意义

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 试验动物及样品采集

2.1.2 主要数据库

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要仪器

2.1.5 常用试剂的配制方法

2.2 试验方法

2.2.1 差异表达miRNAs的定量验证

2.2.2 细胞培养

2.2.3 pcDNA 3.1(+)-miR-331-3p的构建

2.2.4 miR-331-3p与候选靶基因DLST、SLC25A1基因靶向关系的验证

2.2.5 蛋白质免疫印记技术

2.2.6 油红 O 染色细胞鉴定分析

2.2.7 数据处理与分析

3 结果与分析

3.1 差异表达miRNA的验证

3.1.1组织总RNA提取结果

3.1.2 qRT-PCR验证miR-331-3p差异表达

3.2 miR-331-3p调控的靶基因验证

3.2.1 miR-331-3p的靶基因预测

3.2.2 miR-331-3p及靶基因在不同猪种以及组织的表达分析

3.2.3 pcDNA 3.1(+)-miR-331-3p载体的构建

3.2.4 DLST和SLC25A1基因野生型载体和突变型载体的构建

3.2.5 miR-331-3p与预测靶基因DLST、SLC25A1靶向关系验证结果

3.3 miR-331-3p 对猪前体脂肪细胞增殖的影响

3.3.1 前体脂肪细胞免疫荧光鉴定

3.3.2 增殖相关基因的qRT-PCR

3.3.3 CCK8细胞增殖分析

3.3.4 流式细胞术

3.4 miR-331-3p对猪前体脂肪细胞分化的影响

3.5 miR-331-3p对猪前体脂肪细胞脂肪酸代谢的影响

3.5.1 miR-331-3p对基因DLST，SLC25A1基因的调控

3.5.2 miR-331-3p对柠檬酸丙酮酸循环通路的调控

3.5.3油红O染色以及脂肪酸定量

4 讨 论

4.1 miR-331-3p、DLST和SLC25A1差异表达分析

4.2 miR-331-3p对前体脂肪细胞的增殖的影响

4.3 miR-331-3p对前体脂肪细胞的分化的影响

4.4 miR-331-3p对前体脂肪细胞的脂肪酸代谢的影响

5 结 论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况