山东省樱桃病毒病种类分析及卫星RNA控制植物病毒病新策略

摘要

病毒病目前已成为大樱桃产业发展的主要制约因素之一，山东省是我国樱桃种植面积第一大省，樱桃病毒病的系统性调查未见报导；并且现有病毒病防治策略中缺乏可用于控制已发病的多年生木本植物的策略。本研究系首次对山东省大樱桃主产区进行了樱桃病毒病的系统性分析；并且发现了一种可抑制黄瓜花叶病毒（CMV）致病性的卫星RNA，在初步定位核心调控区的基础上，发现此CMV卫星RNA延后接种表现对CMV致病性的控制作用。为多年生木本植物（果树）病毒病的防控提供数据支持和防治策略。主要结果如下： 2016～2018年间，共采集来自山东省13个市、62个县区的110个代表性果园大樱桃样品。110个果园的樱桃感病样品中，针对17种候选病毒进行RT-PCR检测，共检测到8种病毒，分别为樱桃病毒A（Cherry virus A,CVA）、樱桃绿斑驳病毒（Cherry green ring mottle virus,CGRMV）、樱桃小果病毒1（Little cherry virus1,LChV-1）、樱桃小果病毒2（Little cherry virus2,LChV-2）、李树皮坏死与茎痘伴随病毒（Plum bark necrosis stem pitting-associated virus,PBNSPaV）、李属坏死环斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV）、李矮缩病毒（Prune dwarf virus,PDV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）。110个果园的样品中，有93个果园可检测到侵染樱桃的病毒，樱桃园病毒检出率高；潜隐性病毒（CVA、CGRMV）普遍存在，检出率分别为96.8%和43%；造成严重危害的小果病毒（LChV-1、LChV-2）存在率低，检出率分别为11.8%和3.2%。93个检测到病毒的果园中，多病毒侵染现象普遍（95.7%），只最高达8种病毒同时存在一个果园中。山东省不同地区间樱桃病毒病的发生情况分布不均，烟台和泰安检测到樱桃病毒种类最多。 对樱桃园内杂草、昆虫及园区周边植物进行了8种病毒的筛查，从4种杂草商陆（Phytolaccaacinosa）、鸭趾草（Commelina communis）、马齿苋（Portulaca oleracea）、一年蓬（Erigeron annuus）和3种周边木本植物山枣（Ziziphus montana）、石楠（Photinia serrulata）、板栗（Castanea mollissima）中检测到CMV，首次从2种农业害虫绿盲蝽（Apolygus lucorum）和赤须盲蝽（Trigonotylus ruficornis）中检测到CMV，国内外未见报导。针对7种病毒构建了多重RT-PCR体系，此体系可以从田间样品中对7种病毒进行同步高通量检测。以上工作为樱桃病毒病的早期预警、发病规律研究和综合防治提供基础研究材料。 为探索病毒病控制的新策略，以CMV及其卫星RNA为材料开展研究。克隆到长度分别为339nt和383nt两种类型CMV卫星RNA（satCMV TA-Ra和satCMV TA-Tb），系统进化关系较远，推测其具有不同的生物学功能。将satCMV TA-Ra和satCMV TA-Tb的基因组以及基因组互补链分别与CMVFny混合接种，结果显示CMV卫星RNA基因组和CMVFny混合接种组中卫星RNA复制速度快；而CMV卫星RNA基因组互补链和CMVFny混合接种组中卫星RNA积累缓慢。对于CMV卫星RNA基因组和CMVFny混合接种组而言，satCMV TA-Tb可明显抑制CMVFny致病性，表现为CMVFny对本氏烟株高的矮化作用几乎消失，同时叶片发病症状减轻，而satCMV TA-Ra则加重CMVFny致病性，表现为叶片花叶症状加重。CMV基因组RNA和外壳蛋白（CP）的积累水平与发病症状呈正相关。进一步的缺失突变和接种试验表明，CMV卫星RNA（satCMV TA-Ra和satCMV TA-Tb）基因组的5'和3'的最末端10nt序列是保证卫星RNA有效复制的核心调控区；satCMV TA-Tb的5'和3'端各自的第10～20nt或第20～30nt的缺失突变体均可保证卫星RNA有效复制，但不能体现对CMVFny致病性的抑制作用。对于两种类型卫星RNA的中间差异区域而言，satCMV TA-Tb中间区域第142～150nt、164～180nt和199～210nt的缺失突变体，丧失了对CMVFny致病性的抑制作用，而satCMV TA-Ra中间区域91～105nt和111～126nt的缺失突变体，丧失了对CMVFny致病性的加重作用，甚至表现对CMVFny致病性的抑制作用。CMV基因组RNA和外壳蛋白（CP）的检测结果表明，satCMV TA-Tb造成CMV亚基因组RNA4（表达CP蛋白的亚基因组）的相对表达比例降低，其核心调控区是satCMV TA-Tb的199～210nt区域。satCMV TA-Tb是通过降低CMVFny的CP表达来抑制其致病性，是一种新的卫星RNA抑制辅助病毒致病性的机制。 研究了satCMV TA-Tb延后接种对CMVFny的控制作用，发现satCMV TA-Tb延后接种对CMV致病性有明显抑制作用，主要体现为卫星RNA接种后株高矮化作用减弱，同时伴随花叶症状消失。说明在合适时间段的卫星RNA延后接种可有效抑制CMV的致病性，表明卫星RNA延后接种策略是一种防治其辅助病毒的新策略。

目录

声明

缩略词表

1前言

1.1 大樱桃病毒病概述

1.2 大樱桃病毒病种类

1.3 常见樱桃病毒简介

1.3.1樱桃病毒A（CVA）

1.3.2李属坏死环斑病毒（PNRSV）

1.3.3樱桃绿环斑驳病毒（CGRMA）

1.3.4樱桃小果病毒（LChV）

1.3.5李矮缩病毒（PDV）

1.3.6黄瓜花叶病毒（CMV）

1.4 樱桃病毒的检测方法

1.4.1生物学鉴定方法

1.4.2血清学检测方法

1.4.3分子生物学检测方法

1.5 卫星RNA

1.5.1 CMV的卫星RNA的发现

1.5.2 CMV卫星RNA的分类

1.5.3 CMV的satRNA对寄主的影响及机理

1.5.4 CMV卫星RNA的应用

1.6 本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1 材料

2.1.1所用载体及试剂

2.1.2主要实验仪器

2.2.3主要试剂配方

2.2 方法

2.2.1样品采集

2.2.2植物总RNA提取

2.2.3反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）

2.2.4 PCR产物的纯化

2.2.5 cDNA的克隆

2.2.6提取质粒（碱裂解法）

2.2.7序列分析

2.2.8本氏烟种植

2.2.9卫星RNA的体外转录

2.2.10接种CMVFny侵染性克隆菌株

2.2.11 SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳

2.2.12Western blot

2.2.13Northern blot

2.2.14重叠PCR

3结果与分析

3.1 山东大樱桃病毒症状、种类及分布

3.1.1大樱桃病毒病症状

3.1.2山东大樱桃病毒病的病原种类

3.1.3山东大樱桃病毒分布及侵染模式

3.2 大樱桃园内杂草、农业害虫和周边植物中的病毒检测

3.3 樱桃病毒病多重RT-PCR检测体系

3.4 卫星RNA防治病毒病新策略探索

3.4.1 CMV卫星RNA克隆

3.4.2 CMV卫星RNA序列与进化分析

3.4.3不同长度类型CMV卫星RNA对辅助病毒的调控作用

3.4.4 CMV卫星RNA调控CMV致病性的核心区段

3.4.5satCMV TA-Tb延后接种防治CMV病毒病的分析

4讨论

4.1 樱桃病毒种类及分布

4.2 樱桃病毒病多重RT-PCR体系构建

4.3 樱桃园杂草及农业害虫中携带病毒

4.4 樱桃病毒种类与症状潜在关系

4.5 CMV卫星RNA的分类

4.6 CMV卫星RNA结构预测分析

4.7 CMV卫星RNA的影响辅助病毒的新机制

4.8 卫星RNA防治病毒病的新策略

5结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文情况