乳香挥发油对兔视网膜色素上皮细胞增殖、凋亡的影响及其分子机制研究

摘要

目的: 观察乳香挥发油对兔视网膜色素上皮细胞增殖、凋亡的影响，探讨其可能发生的分子机制，以期为乳香防治PVR病变的发生提供新的研发思路。 方法: 采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测不同浓度DMSO对兔RPE细胞增殖的影响，筛选所需溶媒DMSO的浓度；并采用MTT法检测不同浓度5-氟尿嘧啶（5-Fu） （1mg/L、10mg/L、30mg/L、50mg/L）对兔 RPE 细胞增殖的影响；统计分析筛选出低浓度、中浓度及高浓度5-Fu组分别干预兔RPE细胞，采用流式细胞（Flow cytometry，FCM）法检测 5-Fu 对其凋亡率的影响，筛选阳性对照药物的最佳浓度；采用水蒸气回流法提取乳香挥发油，并用不同浓度乳香挥发油（0.15 mg/mL、0.30 mg/mL、0.45 mg/mL、0.60 mg/mL、0.75 mg/mL）干预兔RPE细胞24h、48h、72h，通过MTT法检测其对兔RPE细胞OD值及存活率的影响。统计分析筛选出低剂量、中剂量、高剂量乳香挥发油组。采用FCM法检测正常对照组、溶媒对照组和阳性药物对照组及乳香挥发油低、中、高剂量组兔RPE细胞凋亡率；采用透射电镜（Transmission Electron Micorscope，TEM）观察乳香挥发油对兔RPE细胞形态学的影响；采用蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测各组兔RPE细胞中Bax、Bcl-2蛋白表达情况及Bcl-2/Bax比值的变化。 结果: 1.MTT 法检测不同浓度 DMSO 对兔 RPE 细胞增殖的影响 同时相内：除外 0.2%DMSO干预组，其余浓度DMSO组与正常对照组相比兔RPE细胞存活率呈不同程度降低，差异具有统计学意义（P<0.01），且0.2%DMSO干预组随时间延长，兔RPE细胞的存活率无明显变化（P>0.05）。 2.MTT法、FCM法检测5-Fu对兔RPE细胞存活率及凋亡率的影响 不同浓度5-Fu组与正常对照组相比，细胞OD值及存活率呈不同程度降低（P<0.01），且高浓度5-Fu组细胞凋亡率较其他组明显增高，差异具有统计学意义（P<0.01）。 3.MTT法检测乳香挥发油对兔RPE细胞OD值及存活率的影响 除外0.15 mg/mL乳香挥发油组，其他不同浓度乳香挥发油组与正常对照组相比，细胞OD值及存活率呈不同程度降低，差异具有统计学意义（P<0.01），且随时间延长呈细胞存活率呈逐渐降低趋势。 4.FCM法与TEM法对兔RPE细胞检测发现 同时相内：各组与正常对照组相比，阳性药物对照组以及乳香挥发油中剂量、高剂量组兔 RPE 细胞出现凋亡小体且凋亡率明显增高（P<0.01），并且凋亡率随时间延长明显增加（P<0.05，P<0.01）。 5.Western blot法检测Bax、Bcl-2蛋白表达情况及Bcl-2/Bax比值的变化 同时相内，乳香挥发油中、高剂量组及阳性药物对照组中Bcl-2蛋白相对表达量较正常对照组明显降低（P<0.01），Bax 蛋白相对表达量较正常对照组明显增高（P<0.01），且随乳香挥发油剂量的增加，Bcl-2蛋白与Bax蛋白相对表达量分别有相应降低和增高的趋势。与正常对照组相比，阳性对照药物组、乳香挥发油中剂量及高剂量组可使兔 RPE 细胞中Bcl-2/Bax比值明显降低，即凋亡明显增高（P<0.01），且随着作用时间的延长和剂量的增加，整体观察细胞凋亡呈逐渐增加的趋势。 结论: 1.当DMSO浓度小于总体积的0.2%时即为本实验的溶媒浓度。 2.当 5-Fu浓度为30mg/L 时即为本实验的最佳阳性药物对照浓度。 3.乳香挥发油可抑制兔RPE细胞增殖，并通过上调线粒体信号传导通路Bax蛋白、下调Bcl-2蛋白表达，从而诱导兔RPE细胞发生凋亡，且凋亡程度与剂量及时间相关。

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