蛋白A-增强型绿色荧光蛋白融合基因的构建、表达及其在免疫测定中的应用研究

摘要

开发和应用新的免疫标记物，其目的是为了提高免疫测定的灵敏度、特异性，使测定过程简单、快速。利用基因工程技术直接将抗体或抗原与标记物(如酶)以融合方式表达，可避免繁琐且低效率的酶与蛋白质的化学交联，而且无需先得到纯化的标记物和抗体或抗原。本研究中将增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)基因与葡萄球菌蛋白A(staphylococcalproteinA，SPA)基因重组，表达既有EGFP荧光活性又有蛋白A生物学活性的双功能蛋白质并应用于免疫测定中。EGFP的荧光特性使免疫反应呈绿色荧光可以直接观测，而蛋白A能与多种哺乳动物血清中IgG的Fc段非特异性结合，尝试开发一种特异、灵敏、简便和快速的新型免疫亲和试剂。 我们根据pEZZ18质粒(含蛋白A基因)和EGFP基因(pT1EGFP-N1质粒)序列，设计一对引物，通过PCR扩增得到EGFP基因，构建原核表达载体pEZZ-EGFP。由于EGFP产生荧光不需要加入任何外源底物、酶或其他辅助因子，而且，EGFP发射的荧光用肉眼或荧光显微镜就可以观测到。在转入pEZZ-EGFP质粒的细菌中表达EGFP融合蛋白可使菌落呈现绿色，可在氨苄青霉素抗性平板上直接筛选绿色菌落，即为阳性重组转化子。在原核表达载体pEZZ-EGFP系统中，外源基因表达由Lac启动子与金黄色葡萄球菌蛋白A启动子双重控制非诱导型表达，有利于外源蛋白的分泌。利用金黄色葡萄球菌蛋白A的信号肽序列，可将外源基因的表达产物分泌到培养基中。另外5'端蛋白A的IgG结合区序列(ZZ)，亦可以提高外源蛋白的可溶性，提高其分泌效率。 利用大肠杆菌表达PA-EGFP融合蛋白，通过对表达产物的纯化、荧光活性和ELISA竞争实验，表明构建的原核表达载体pEZZ-EGFP中ZZ序列、EGFP序列和6×His序列在EcoliDH5α都已正确表达；SDS-PAGE法测定的PA-EGFP融合蛋白相对分子量与理论值相近，具有绿色荧光蛋白及蛋白A两者的生物活性，且PA-EGFP融合蛋白的荧光激发光谱、荧光发射光谱(Ex=489nm，Em=511nm)与报道相一致。PA-EGFP融合蛋白的荧光强度与其浓度的线性关系较好(r=0.99848)，只需对培养上清进行荧光强度测量即可简单、快速地检测液体培养基中PA-EGFP分泌表达水平的高低。利用E.coliDH5α表达PA-EGFP融合蛋白，在LB液体培养基中同时含有终浓度1％TritonX-100及1％甘氨酸，可使液体培养基中PA-EGFP融合蛋白的分泌表达量提高6倍以上(6.44mg/L)。 利用PA-EGFP检测包被于NC膜的兔IgG抗体，在紫外灯(365nm)下其检测灵敏度为50ng，低于HRP/DAB检测(6.25ng)，但PA-EGFP检测不需底物显色等步骤，与HRP/DAB检测相比较，其检测过程更加简单、快速。在免疫细胞化学实验中，兔抗大鼠Actin多抗为一抗标记大鼠神经神经细胞，PA-EGFP为替代二抗，检测PA-EGFP的标记效果。荧光显微镜视野中有许多亮绿色荧光网状结构，可较好地观察到大鼠神经细胞质内被PA-EGFP融合蛋白特异性显示的肌动蛋白。

目录

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摘要

符号说明

第一章前言

第二章蛋白A-增强型绿色荧光蛋白融合基因原核表达载体的构建

第三章蛋白A-增强型绿色荧光蛋白融合基因在大肠杆菌中的表达

第四章蛋白A-增强型绿色荧光蛋白融合基因在大肠杆菌中表达条件的优化

第五章蛋白A-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白在免疫测定中的应用

论文总结

附录

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文