聚羟基脂肪酸酯产生菌筛选及其在E.coli工程菌中表达与代谢机理研究

摘要

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates或PHA)是很多细菌合成的一种细胞内聚酯，在生物体内主要是作为细胞内碳源和能源的贮藏性物质而存在。由于具有诸如生物可降解性、生物相容性、光学性、压电性、气体相隔性等许多优良性能，而可以应用在众多领域。作为一类难以降解石油烃制品的替代品，PHA可以减轻对土壤和水体的污染，因而被广泛关注并应用。PHA这些年的研究重点在于中长链聚羟基脂肪酸酯(PHA McL)作为特殊的生物高分子材料的开发，由于聚酯的结构可以进行调整，因此高分子的性能就可以很容易的调控以适合特定的要求。这些特殊产品的附加值非常高，因此在生物医药方面的应用前景诱人。 本论文从32株油田分离的菌株，筛选得到高产PHA、PHB的菌株各一株。首次报道了交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas)深海适冷菌SM9913，胞内合成PHA；并对生理生化性质及发酵培养条件进行了研究。在其中一株铜绿假单胞菌中，克隆得到phaJ,phaC基因，构建了包括两个脂肪酸代谢相关基因的PHA表达载体。旨在应用基因工程的方法，将外源的PHA合成相关基因在大肠杆菌工程菌株中进行表达，构建了一条新的PHA合成加强型的代谢通路，使受体菌获得高效产生PHA的能力。同时对PHA在细菌体内合成机制，引发机制及对其新陈代谢的调控机制进行研究。阐述了fadD基因在脂肪酸氧化途径中对FadR因了解阻遏作用，揭示了中链脂肪酸被利用的机理；并提出了在大肠杆菌重组菌PHA合成过程中对脂肪酸脱毒作用的概念；从而为合成新型PHA提供理论依据和技术帮助；为最终将产PHA的工程菌应用到医药行业等领域做准备。不同结构的羟基脂肪酸酯是在与其单体结构相关的底物培养中获得的。石油是一种组成复杂的烃及非烃的混合物，富含长链脂肪酸、烷酸等烃类组分，是筛选野生型产中长链PHA的首选样本。从油田和长期被石油污染的土壤中取样，进行菌种纯化，从中分离出许多能以原油为碳源进行生长的菌株，各菌株对不同链长的烃的利用情况不同，继而分离和筛选烷烃和脂肪酸强势利用菌，初筛得到PHA产生菌株。经过菌种鉴定分析表明这些菌株主要是以假单胞菌(Pseudomonas)和芽孢杆菌(Bacillus)为主。结合尼罗红染色实验，在分别添加了葡萄糖和癸酸盐为唯一碳源的M9平板，对各菌株富集培养，观察菌株对两种碳源的利用和生长情况，初步确定产PHA的种类和含量。复筛得到两株高产PHA菌。经形态及生理生化鉴定与16S rDNA序列分析，将DQ2菌株鉴定为芽胞杆菌属产PHB的菌株，M3为假单胞菌属产PHA的菌株。对Bacillus DQ2产PHB的发酵条件进行了摸索，测定该菌株最适发酵条件为30℃，2％葡萄糖的液体LB培养基，200rpm摇床振荡培养48h。另外，筛得的产PHA的Pseudomonas M3菌株对照铜绿假单胞菌的生理生化指标及产PHA产物检测，都弱于后者。所以该论文后面的试验拟以铜绿假单胞菌为模式菌株，克隆和表达参与PHA合成各相关基因重组在大肠杆菌中。另外，发现了一株深海低温适冷菌．Pseudoalteromonas．Sp.SM9913(海洋交替假单胞菌属)胞内具有合成PHA的能力。采用尼罗红染色、透射电镜观察、HPLC检测等多种方法检测了PHA产物。初步研究了该菌株PHA的发酵培养条件，并对P.sp.SM9913在胞内合成PHA的同时，生成脂多糖的代谢机理进行了初步讨论。铜绿假单胞菌中的PhaJ和PhaC在PHA McL的生物合成中起重要作用。其中，PhaJ基因编码的R-特异的烯酯酰辅酶A水合酶，催化合成PHA McL所必需的前体物R-3-羟基酯酰辅酶A。PhaC是PHA合成的关键酶，能够用羟基脂肪酸(HA)的辅酶A硫脂作底物，催化HA脱去辅酶A聚合成PHA。本实验分别将PhaJ2和PhaC 1构建在高表达的质粒系统pBB R 1 MCS-2和pBluscipript SK上，并共转化到表达型大肠杆菌13H50t及脂肪酸FadR缺失突变株LS5218中，通过IPTG诱导进行表达。初步检测了表达产物的单体结构和含量。在大肠杆菌LS5218突变株中pBBRJ和pSKC质粒表达的PhaJ和PhaC共同作用下的菌株都具有PHA <,McL>的合成能力，使胞内PHA合成大大提高。外加pBBRED)质粒，采用额外添加脂肪酸氧化过程中的acvl-CoA合成酶(fadD基因编码)和acyl-CoA脱氢(fadE基因编码)，并过量表达这两个酶，加快代谢β-一氧化的前半罔循环，使更多的羟基脂肪酸进入PHA合成代谢途径，从而降低了β-氧化的前体物供给，脂肪酸β-氧化下降。在癸酸盐为底物的培养中，重组菌株E.coli DH5a(pBBREDJ,pSKC)能够催化生成大量的十碳链长烯酰辅酶A进入PHA合成途径，胞内大量合成聚羟基癸酸酯(PHD)产物。从而得到高浓度(81％)的3HD的聚合单体，使通过调控合成中链长羟基脂肪酸的匀聚物成为可能。 PHA的合成途径主要与合成的是短链或中长链PHA有关，目前己知的PHA合成途径主要分成三种。其中与PHA <,McL>合成途径关系最密切的是脂肪酸β-氧化过程。虽然对这一过程已经研究了几十年，但对于原核生物中脂肪酸β-氧化的机理还没有完全掌握。基于实现PHA<,McL>产业化的迫切要求，PHA相关代谢途径调控机理研究，成为本文着重研究讨论的方向。 野生型大肠杆菌可以利用环境中的长链脂肪酸(C>l 2)作为唯一碳源生长，但不能直接利用中链脂肪酸(C6-ClO)。本研究首先克隆了太肠杆菌K12的fadD、fadE基因。当表达有fadD基因的大肠杆菌接种在癸酸盐(C10)作为唯一碳源的培养基上时，发现了明显的生长。然而，当不含有fadD基因的大肠杆菌E.coli DH5a，在C10作为唯一碳源的培养基上不生长。为了更好的验证fadD基因的作用规律，将这一基因分别构建到不同的大肠杆菌菌株：E.coli MGl655，E.coli MC1061，E.coli UB1005，以及fadD基因突变菌株E.coli DC374中。这些菌株在表达外加fadD基因时，都能利用中链脂肪酸生长，而各对应的野生型菌株则不能生长。进一步，通过半定量RT-PCR的分析检测方法，检测到由过量表达的fadD基因在C10的存在下，诱导的fadE和fadBA基因在转录水平上大量增多。由此对fadD基因调节脂肪酸代谢的机理作如下解释：过量表达fadD基因，可以在细胞内生成大量的中链脂酰辅酶A，它在量上的变化，调控并改变了脂肪酸代谢调控因子FadR对DNA转录链的结合，使脂肪酸氧化的下游基因转录并表达，从而解除了FadR在降解脂肪酸β-氧化过程中的阻遏作用，使中链脂肪酸得以降解利用。据此得出结论，并非只有长链脂酰辅酶A具有结合FadR的能力，大量中链的脂酰辅酶A也可以结合FadR，解除了FadR对脂肪酸代谢相关酶的负调控，中链长脂肪酸可以进入脂肪酸β-氧化途径，菌体可以利用脂肪酸作为供能物质生长。FadD作为脂肪酸氧化过程中的关键酶，可以改变对FadR阻遏蛋白的调控，对脂肪酸β-氧化过程的调控机制提出了新的见解和补充。PHA代谢合成的生物途径，作为脂肪酸β-氧化的一个旁路途径，不仅可以加快脂肪酸的代谢，而且可以利用脂肪酸氧化的中间产物，将脂肪酸氧化的碳源转移到PHA的合成上，将更多的脂肪酸中间体引入旁路途径的方式，可以减缓脂肪酸对细胞的毒性，达到一定的脱毒功效。本实验克隆了来自于铜绿假单胞菌phaC1和phaJ2基因，在合成PHA的重组大肠杆菌的生长实验中验证并阐述了这一机制。尽管重组大肠杆菌不会分泌任何胞外酶，但拥有PHA合成酶的重组大肠杆菌可以更多更快的利用外源的脂肪酸，作为提供它合成PHA的前体物质，结果是较其它菌株降低了脂肪酸的毒性。实验结果显示当脂肪酸浓度提高到一定浓度：C8，3.O gL<'-1>；C10，2.0 gL<'-1>；C12，1.5 gL<'-1>；C18，0.125 gL<'-1>，F.coli LS5218的生长受到影响；然而E.coliLS5218(pSKC，pBBRJ)在此浓度下仍可以正常生长。且给出了菌株耐受不同碳链长度脂肪酸毒性的浓度水平。本实验首次在大肠埃希重组菌中，证实了产PHA重组菌株，对脂肪酸有脱毒利用的功能。低浓度的烷烃、脂肪醇、脂肪酸等底物对微生物有毒害作用，转化生成PHA，可以快速除去这些底物，可以提高微生物的生存能力同时积累表达产物。

目录

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摘要

本论文的缩写词表

第一章绪论

第二章产PHA菌株的筛选鉴定及产物分析

第三章产PHA重组大肠杆菌的构建及产物分析

第四章PHA产生菌代谢机理研究

参考文献

致谢

研究生在读期间发表的论文