Ⅱ型猪圆环病毒ORF2、ORF3基因的克隆表达与潜在应用研究

摘要

II型猪圆环病毒(Porcine corcirvims type II，PCV2)可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾炎综合征、先天性震颤等多种疾病，临床表现为生长迟缓、进行性消瘦、呼吸困难、贫血、黄疸和腹泻等症状，急性暴发猪群的死亡率可高达50％，对世界养猪业造成了极大的危害。目前，尚无有效预防和治疗措施，这与还没有有效的疫苗以及病毒的基础研究尚不清楚有关。本文对该病毒的衣壳蛋白(抗原蛋白)编码基因orf2和新发现的orf3基因进行了克隆表达与应用研究，以期为研究防治PCV2有效疫苗和PCV2致病机理奠定理论基础。 本论文分别从山东省6个地区的6份阳性病料中PCR扩增orf2基因和orf3基因。以orf2为靶基因进行6个毒株的分子流行病学分析。序列同源性分析表明，6个毒株之间的核苷酸序列同源性为93.3～99.7％，氨基酸序列同源性为92.3～100％；氨基酸序列存在2个高变区，分别位于序列的57～90位和190～220位的区域，其中57～90区域位于结构蛋白的免疫反应活性区；遗传进化分析显示，SDI、SD III、SD V、SD VI与法国株(AY322000)和中国农大株(EF524521)共同形成一群，可能起源于共同的祖先；SDⅡ、SDⅣ与其他7株PCV2毒株共同形成另一大群，与海南株(AY556476)的亲缘关系最近；结合GenBank报道的山东境内分离的13个PCV2毒株的orf2基因序列进行RFLP分析，可将山东省PCV2流行毒株分为CHN-2H型、CHN-2F型、CHN-2I型和两种新的基因型，命名为CHN-2J型和CHN-2K型。其中，CHN-2H型所占比例最高，为优势基因型，是引起山东省规模化猪场暴发PCV2疾病的主要基因型，也与我国PCV2流行的优势基因型相一致，因此我们以此基因型为主研制防治PCV2的疫苗。 乳酸菌在食品发酵业具有悠久的应用历史，是公认的安全(GRAS)细菌。以乳酸菌作为活疫苗载体，靶向表达医用蛋白和抗原物质，已成为医药研究领域的热点之一。为研制开发一种更为方便、安全、有效的口服PCV2活疫苗，我们构建了重组PCV2衣壳蛋白的乳球菌分泌型活疫苗载体，将去核定位信号的orf2基因(dCap)克隆入E.coli/L.lactis穿梭表达载体pSEC和pSEC：LEISS。SDS-PAGE和Western blot分析证明dCap蛋白在pSEC-dCap重组菌和pSEC：LEISS-dCap重组菌的菌体内都得到诱导表达，而且pSEC：LEISS-dCap重组菌实现了蛋白的分泌表达。通过对诱导温度、诱导OD值、nisin诱导浓度和诱导时间四个因素的条件优化，确定pSEC：LEISS-dCap重组菌最佳的诱导表达条件为：在OD600=1.0～1.2时加入终浓度为10～12ng/ml的nisin，18℃诱导6小时，分泌的dCap蛋白量可达1.2mg/L，比优化前提高2倍。作为乳酸菌口服活疫苗制品，能否顺利通过胃肠道环境并存活于肠道，同时将表达的抗原呈递到免疫相关部位，是其能够发挥功效的的关键环节。为了衡量构建的重组乳球菌NZ9000/pSEC：LEISS-dCap的疫苗应用潜力，我们对其进行了体外模拟胃肠道环境的耐受力检测和小鼠活体免疫原性分析。结果表明，重组乳球菌对6％NaCl浓度的高盐环境具有较强的耐受能力；可以耐受pH1.5-4.5的胃液环境；在人工肠液中出现较明显的生长趋势；但是对浓度为0.1％以上的胆酸盐耐受力较差(体内胆盐浓度为0.03～0.3％)。因此，在作为口服活疫苗应用时，应进一步对菌株进行改造，提高菌株的耐胆盐能力，以利于菌株在胃肠道环境中的生存和释放抗原蛋白。NZ9000/pSEC：LEISS-dCap重组菌培养液口服灌喂BALB/C小鼠对小鼠的生长发育没有影响，无毒性作用；能够诱发小鼠机体产生抗Cap蛋白的特异性抗体，血清中IgG含量较对照组有显著性差异(P＜0.02)，能够刺激肠道粘膜淋巴组织对其产生粘膜免疫反应。因此，作为疫苗制品具有很大的应用和开发潜力。 ORF3蛋白是新发现的PCV2的非结构蛋白，其功能目前尚不明确。为了对其功能进行研究，我们分别从三个方面开展工作：首先，采用PCR重叠延伸突变法对orf3基因进行同义突变，结果使orf3基因的8个稀有密码子替代转化为E.coli偏爱的密码子，以突变的orf3基因构建E.coli表达载体，实现了ORF3蛋白在E.coli中的高效表达，得到纯化的ORF3蛋白。为下一步开展ORF3蛋白的性质研究和制备ORF3蛋白抗血清做好准备；其次，基于ORF3蛋白及其受体蛋白与p53蛋白(肿瘤抑制因子)密切相关的研究背景，开展了ORF3蛋白对肿瘤细胞的凋亡诱导作用研究，构建了pEGFP-ORF3真核荧光表达载体，转染大肠癌细胞HT 29和胃癌细胞SGC 7901，48小时后细胞形态和细胞核形态均表现出明显的凋亡特征，流式细胞仪检测显示细胞被阻滞在G0-G1期，LDH活性检测细胞的死亡方式为凋亡，而非坏死。表明ORF3蛋白具有诱导大肠癌细胞HT29和胃癌细胞SGC 7901凋亡的作用，为下一步开展凋亡途径和凋亡机制的研究打下基础；最后，对ORF3蛋白介导的T淋巴细胞免疫反应进行研究。构建真核表达载体pcDNA-ORF3，以肌肉注射方式导入小鼠体内，观察ORF3蛋白对小鼠T淋巴细胞的作用。结果显示小鼠血液T淋巴细胞亚群的CD4+、CD8+数量升高，CD4/CD8比值仍处于正常范围，表明诱导小鼠产生了一定的由CD4+、CD8+T淋巴细胞介导的细胞免疫应答。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明及缩写词

声明

第一章绪 论

1.1猪圆环病毒的分类地位

1.2Ⅱ型猪圆环病毒的分子生物学

1.2.1病毒的基因组

1.2.2病毒的复制与转录

1.2.3病毒编码的蛋白

1.3 Ⅱ 型猪圆环病毒的流行病学

1.3.1病毒的流行状况与分布

1.3.2病毒的基因型

1.3.3病毒的自然史

1.4 Ⅱ 型猪圆环病毒的致病机理研究

1.4.1病毒引起免疫抑制

1.4.2免疫刺激的影响

1.5Ⅱ型猪圆环病毒的疫苗研究进展

1.6以乳酸菌为载体的疫苗研究进展

1.6.1乳酸菌是理想的活疫苗载体

1.6.2乳酸菌活疫苗载体的构建

1.6.3乳酸菌活疫苗载体的应用

1.6.4乳酸菌活疫苗载体的展望

1.7本文的研究意义和主要研究内容

第二章Ⅱ型猪圆环病毒山东分离株的分子流行病学研究

2.1引言

2.2材料

2.3方法

2.3.1病毒DNA的提取

2.3.2 orf2基因PCR扩增

2.3.3 PCR产物纯化、连接、转化

2.3.4重组质粒的验证

2.3.5序列的生物信息学分析

2.4结果

2.4.1 orf2基因的克隆与测序

2.4.2序列同源性分析

2.4.3遗传进化分析

2.4.4基因型分析

2.5讨论

2.6小结

第三章Ⅱ型猪圆环病毒乳酸菌活疫苗载体的构建

3.1引言

3.2材料

3.3方法

3.3.1去核定位信号orf2基因的扩增

3.3.2 L.lactis/E.coli穿梭表达载体的构建

3.3.3乳酸乳球菌的电转化

3.3.4重组乳酸乳球菌的表达及SDS-PAGE分析

3.3.5 Western blot分析

3.3.6分泌表达条件优化

3.4结果

3.4.1去核定位信号orf2基因的克隆

3.4.2重组质粒酶切验证

3.4.3 dCap蛋白在乳酸乳球菌中的表达

3.4.4 Western blot实验

3.4.5重组乳球菌表达条件优化

3.5讨论

3.6小结

第四章重组乳球菌对胃肠道耐受能力检测与免疫原性分析

4.1引言

4.2材料

4.3方法

4.3.1耐渗透压能力的测定

4.3.2耐胆酸盐能力的测定

4.3.3对胃转运耐受能力测定

4.3.4对肠转运耐受能力测定

4.3.5口服样品的处理

4.3.6小鼠免疫程序

4.3.7小鼠平均日增重的测定

4.3.8胸腺指数、脾脏指数的测定

4.3.9脾淋巴细胞转化试验

4.3.10小鼠血清中抗体的ELISA检测

4.3.11小鼠Peyer’s结的评定

4.4结果

4.4.1耐渗透压实验

4.4.2耐胆酸盐能力测定

4.4.3胃转运能力的测定

4.4.4肠转运能力的测定

4.4.5对小鼠生长发育的影响

4.4.6对小鼠T淋巴细胞转化效果

4.4.7小鼠血清抗体IgG的检测

4.4.8小肠Peyer’s结的变化

4.5讨论

4.6小结

第五章ORF3蛋白诱导大肠癌和胃癌细胞凋亡的初步研究

5.1引言

5.2材料

5.3方法

5.3.1肿瘤细胞复苏、传代、冻存

5.3.2 pEGFP-ORF3载体构建

5.3.3转染用质粒的提取

5.3.4细胞转染

5.3.5 RT-PCR检测ORF3 mRNA的表达

5.3.6倒置显微镜观察

5.3.7荧光显微镜观察

5.3.8激光扫描共聚焦显微镜观察

5.3.9流式细胞仪检测细胞凋亡

5.3.10 LDH酶活浓度测定

5.4结果

5.4.1 pEGFP-ORF3真核荧光表达载体的构建

5.4.2细胞内荧光检测

5.4.3 RT-PCR检测细胞内ORF3 mRNA的表达

5.4.4 ORF3诱导的细胞形态学变化

5.4.5激光扫描共聚焦显微镜观察细胞荧光与凋亡

5.4.6 ORF3诱导的细胞核形态学变化

5.4.7 ORF3对细胞周期的影响

5.4.8 LDH酶活检测

5.5讨论

5.6小结

第六章orf3基因的克隆表达及诱导小鼠细胞免疫的研究

6.1引言

6.2材料

6.3方法

6.3.1 orf3基因的大肠杆菌表达载体构建

6.3.2 orf3基因中稀有密码子的同义突变

6.3.3 ORF3蛋白的纯化

6.3.4 orf3基因真核表达载体的构建

6.3.5小鼠给药程序

6.3.6小鼠血液中DNA的提取

6.3.7小鼠T淋巴细胞亚群数量的检测

6.4结果

6.4.1 orf3基因E.coli表达载体的构建

6.4.2 orr3基因中稀有密码子的同义突变

6.4.3 ORF3蛋白的诱导表达

6.4.4 ORF3蛋白的纯化

6.4.5 orf3基因真核表达载体的构建

6.4.6血液中orr3基因检测

6.4.7小鼠T淋巴细胞亚群数量的检测

6.5讨论

6.6小结

结语

创新点

附录

参考文献

攻读博士学位期间发表的文章

致谢

外文写作一

外文写作二