孕妇血浆中胎儿DNA和比较基因组杂交技术在产前诊断中的应用研究

摘要

本研究分为二部分。第一部分为定性研究。通过对O型血孕妇血浆中游离胎儿。DNA进行定性检测，以探讨利用孕妇外周血中游离胎儿DNA进行无创性产前诊断胎儿ABO血型的可行性。第二部分为定量研究。利用实时定量PCR技术，对妊娠21三体孕妇和唐氏高危孕妇及正常孕妇的血浆中DNA进行定量检测，目的是寻找一种无创性、快捷、经济的产前筛查唐氏综合征胎儿的新方法；同时探讨游离胎儿DNA的来源和含量变化的机制，以便为游离胎儿DNA更好地应用于无创性产前诊断奠定基础。 目的：本研究通过提取O型血孕妇血浆中的游离DNA，利用PCR-SSP 技术对胎儿ABO血型基因型进行了无创性产前诊断的研究，目的是探讨这一无创性产前诊断方法的可行性和准确性。 方法：选择孕中晚期单胎O型血孕妇105例，其丈夫血型为非O型。采用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取孕妇血浆中游离DNA；采用QIAamp DNA BloodMaxi Kit提取脐血基因组DNA，PCR-SSP方法检测ABO血型基因型，基因分型采用A1.2BO1.2方法。同时对夫妇双方及其新生儿用传统的血清学方法检测其ABO血型表现型。在利用游离DNA获得胎儿血型结果之前，对新生儿的血型表现型是未知的。 结果：(1)利用脐血DNA，105例孕妇新生儿血型经PCR-SSP方法均正确诊断。(2)利用孕妇血浆中游离DNA，93例胎儿血型基因型与脐血DNA血型基因型相符，即诊断符合率为88.6％(93/105)。12例血型产前诊断不符的胎儿均来自于66例妊娠非O型血胎儿的孕妇；39例妊娠O型血胎儿的孕妇的胎儿血型基因型均正确检出。另外，孕中期的诊断符合率低于孕晚期。(3)5例经产妇本次妊娠胎儿血型与以前子女血型不同，但利用孕妇血浆中游离DNA均能准确检测。 结论：利用O型血孕妇血浆中游离DNA进行无创性产前诊断胎儿.ABO血型是一种可行途径，PCR-SSP方法检测ABO血型基因型结果可靠，且简单快捷.易于操作，值得在母儿血型不合和新生儿溶血病的预防、诊断等应用、推广。 目的：本研究拟采用TagMan探针实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)技术，通过测定妊娠DS胎儿孕妇和唐氏高危孕妇血浆中游离胎儿DNA含量，寻找一种无创性的产前筛查DS的新方法；同时，通过观察游离胎儿DNA含量与孕妇血β-HCG浓度的关系，对孕妇血浆中游离胎儿DNA的组织来源以及含量变化的机制作深入的探讨，为游离胎儿DNA更好的应用于无创性产前诊断奠定基础。 方法：选择妊娠DS男胎孕妇5例；唐氏高危孕妇39例，其中孕男胎孕妇21例；唐氏低危正常孕妇42例，其中孕男胎孕妇22例。OIAamp Blood DNA MiniKit提取孕妇血浆中游离DNA，采用化学发光免疫分析法测定孕妇血清β-HCG值，Real-time PCR定量检测孕妇血浆中游离DNA含量，其中DYS14基因和β-actin基因分别代表孕妇血浆中胎儿DNA和孕妇血浆总DNA。通过组间可比性控制，比较正常妊娠组、妊娠DS组妇女及唐氏筛查高危孕妇血浆中游离胎儿DNA的含量，同时对孕妇的血浆中胎儿DNA含量与血β-HCG浓度进行Pearson相关分析。 结果：(1)建立了Real-time PCR检测DYS14基因及β-actin基因定量标准曲线。(2)Real-time PCR方法检测DYS14基因的敏感性和特异性均为100％。(3)妊娠DS男胎孕妇血浆中胎儿DNA含量127.4±58.4 GE/ml是正常男胎孕妇48.5±20.8-GE/ml的3.1倍，是唐氏高危男胎孕妇78.4±28.0GE/ml的1.4倍，唐氏高危男胎孕妇血浆中胎儿DNA含量也明显高于正常男胎孕妇，以上两两比较，经t检验差异具有显著性(P＜0.01)；妊娠DS男胎孕妇、唐氏高危男胎孕妇和正常男胎孕妇三组之间，经两两比较，其血浆中总DNA含量无统计学差异(P＞0.05)。(4)妊娠DS男胎孕妇血β-HCG浓度96.8±42.9 1IU/ml明显高于唐氏高危男胎孕妇58.1±25.3 IU/ml和正常男胎孕妇38.1±19.4 IU/ml，唐氏高危男胎孕妇血β-HCG浓度也明显高于正常男胎孕妇，两两比较，经t检验差异具有显著性(P＜0.01)。(5)孕妇的血浆中胎儿DNA含量与血β-HCG浓度两者相关且具有统计学极显著性意义(r=0.86，P＜0.0001)。结论：(1)Real-time PCR技术具有敏感、特异、快速、操作简便、高通量等优点，适合于临床大规模产前筛查及诊断，利用其进行无创性产前诊断胎儿性别的灵敏度和特异性可达100％。(2)孕妇血浆中的游离胎儿DNA的定量检测可以作为产前筛查DS的候选指标。(3)胎儿DNA含量需联合其它指标才能有效地反映胎儿的发育情况，才可以作为唐氏筛查的有效诊断手段。(4)β-HCG是唐氏筛查的敏感标志物之一。(5)游离胎儿DNA升高与血β-HCG变化密切相关，本文在国内首次提出合体滋养层细胞是孕妇血浆中游离胎儿DNA主要来源，DS妊娠孕妇血浆中胎儿DNA异常升高的发病机制为合体滋养层细胞凋亡增加、破坏后释放进入母血循环所造成。 目的：本研究通过对CGH技术进行改进，拟建立方便实用的CGH方法路线，即荧光互换CGH。并采用这一技术对部分产前筛查高危病例及畸形胎儿进行产前胎儿染色体检查，通过与传统细胞遗传学结果比较，以检验其敏感性和可靠性。为产前诊断胎儿染色体异常提供一个更好的有益的手段，以提高围产儿优生率，同时为更好的认识和分析畸形胎儿的病因机制奠定基础。同时这一技术平台的建立对于下一步利用CGH更好的开展胚胎植入前遗传学诊断以及应用母体外周血中胎儿细胞进行无创性产前诊断胎儿染色体异常都具有很深的意义。 方法：选取唐氏综合征筛查结果为高风险并且细胞遗传学结果异常的孕妇5例，因胎儿畸形、死胎引产的孕妇12例。采用Tiangen DNA抽提试剂盒提取研究对象羊水或脐血基因组DNA，Vysis缺口平移试剂盒标记待测DNA和对照DNA，每份样本均分别标记SpectrumGreen和SpectrumRed。将等量的SpectrumGreen标记的待测DNA、SpectrumRed标记的正常对照DNA与Cot-1 DNA混匀、沉淀、制成混合探针，加至正常中期染色体玻片的杂交区域，73℃共变性，37℃杂交48-72小时，然后洗片、复染，荧光显微镜进行中期染色体分裂相的选择、摄像。同时进行荧光互换CGH:将待测DNA和对照DNA的荧光颜色互换，即SpectrumRed标记待测DNA、SpectrumGreen标记正常对照DNA。最后使用CGH软件进行图像分析，根据绿红两种信号的比值，即每一染色体上的荧光强度比制作CGH拷贝数核型模式图，以1.0表示平衡比例，FR阈值定为1.25和0.75，三体或染色体片段的扩增定义为FR＞1.25，1.5以上视为高水平扩增；单体或染色体片段的缺失定义为FR＜0.75。细胞遗传学结果在CGH实验分析结束后知晓。 结果：(1)本实验建立的CGH方法杂交效果好，染色体涂染均匀，背景干净。来自17例入选孕妇的胎儿样本均成功的利用荧光互换CGH方法进行了分析、确认。(2)荧光互换CGH共检出21三体3例，18三体和45，XO各1例，与细胞遗传学分析结果完全一致。2例CGH和细胞遗传学分析均未发现染色体缺失或扩增，其中1例为Dandy-Walker畸形。(3)1例细胞遗传学分析仅能判断4号染色体的长臂远端部分缺失，而荧光互换CGH发现该病例是4号染色体4q32-qter的缺失，其核型为46，XY，Del 4q32-qter。(4)9例孕妇由于羊水/脐血太少或死胎致培养失败等原因未能进行细胞遗传学分析，其中3例CGH检测出染色体不平衡并通过荧光互换CGH得到了确认。1例CGH核型为Dup 21，初步考虑该患儿核型为21三体，但在荧光互换CGH中仅检测到了21q的扩增；1例荧光互换CGH证实核型为Del 2p24-pter，Dup 12p13；1例在排除了22p异染色质区域的杂交偏移后，其CGH核型为Del 1p33-pter，Del 22q11-12，结合临床考虑为腭-心-面综合征。 结论：(1)在CGH流程中有诸多因素会影响最终的分析结果，荧光互换CGH能够最大程度的排除在实验过程中可能产生的误差，同时对变性方法进行改善，大大增加了染色体异常病例检出的准确性和可靠性。目前这一方便实用的荧光互换CGH路线系本文首次报道。(2)荧光互换CGH可靠准确，为更好地产前诊断胎儿染色体异常提供了一个有益的手段，特别是对于传统细胞遗传学无法进行分析时尤有意义，而且较传统细胞核型分析更加灵敏，可以作为产前诊断中传统核型分析的有益和必要补充。(3)染色体某些片段的异常与胎儿某种畸形有对应关系，染色体异常是胎儿畸形的重要病因之一，但是部分畸形如Dandy-Walker等并非染色体异常。

目录

论文说明:符号说明

声明

第一部分孕妇血浆中胎儿DNA在无创性产前诊断中的应用研究

前 言

论文Ⅰ利用孕妇血浆中游离胎儿DNA进行无创性产前诊断胎儿ABO血型

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

结 论

论文Ⅱ实时定量PCR检测孕妇血浆中DNA及其在唐氏筛查中的应用

前 言

材料和方法

结 果

讨 论

结论

参考文献

第二部分比较基因组杂交技术的改进及其在产前诊断染色体异常中的应用

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

结论

附图

参考文献

致谢

攻读博士学位期间的科研成果

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