脂联素通过血管外膜干预脂多糖介导的氮氧化应激的实验研究

摘要

脂联素受体在血管外膜及血管外膜成纤维细胞中表达的研究
　　 本研究的目的：1探讨脂联素受体在血管外膜及血管外膜成纤维细胞上的表达情况；2在炎症状态下，血管外膜成纤维细胞表达脂联素受体的变化。通过这一研究，为进一步研究脂联素通过血管外膜发挥抗炎和抗动脉粥样硬化作用奠定基础。
　　 方法：1细胞培养：剥脱小鼠胸主动脉的外膜，用组织贴块法进行原代细胞培养，当达到80-90融合时传代，实验采用第4-8代细胞。分别用α-SM-actin单抗(1：200)和波形蛋白(Vimentin)单抗(1：300)和二抗TRITC(1：100)进行免疫细胞荧光染色，鉴定所培养的细胞是否是所需要的AF及其纯度。2实验分组：
　　 (1)根据LPS的刺激浓度分组
　　 (2)根据LPS的不同刺激时间分组
　　 3 RT-PCR：观察正常血管外膜组织、骨骼肌组织及肝组织脂联素受体的表达及正常及LPS刺激后，血管外膜成纤维细胞(AFs)上AdipoR1及AdipoR2的表达，采用“2-△△CT方法”分析基因的表达量。
　　 4蛋白印迹分析：观察正常血管外膜组织、骨骼肌组织及肝组织脂联素受体的表达及正常及LPS刺激后，AFs上AdipoR1及AdipoR2的表达。强弱用表达的蛋白和β-actin条带积分光密度的比值表示。
　　 5免疫细胞荧光染色：观察正常及LPS刺激后，FITC和TRITC二抗标记的α-SM-actin、vimentin、AdipoR1及AdipoR2在AF中的表达，用IOD比较它们在不同分组间表达的强弱。
　　 结果：
　　 1 AF的孵育和鉴定：
　　 2脂联素和脂联素受体的表达：
　　 3 LPS刺激下脂联素受体1的表达：
　　 创新性及局限性：
　　 1.创新点
　　 (1)应用RT-PCR、western blot及免疫细胞荧光等多种方法证实了血管外膜成纤维细胞上存在着脂联素受体，尤其是脂联素受体1，在国内外未见报道。
　　 (2)在LPS刺激下，血管外膜成纤维细胞脂联素受体1表达降低，呈时间和剂量依赖性。
　　 2.局限性
　　 (1)因技术所限，未能对脂联素受体进行进一步的功能研究。
　　 (2)未对脂联素受体在炎症刺激下表达降低的机制进行进一步的探讨。
　　 结论：
　　 (1)正常血管外膜及血管外膜成纤维细胞可以表达脂联素受体，其中脂联素受体1高表达，脂联素受体2低表达，而血管外膜成纤维细胞几乎不表达脂联素。提示脂联素可能通过旁分泌途径作用于血管外膜成纤维细胞。
　　 (2)血管外膜成纤维细胞脂联素受体1的表达量与LPS刺激浓度和时间呈负相关。
　　 背景：
　　 本研究目的：1探讨脂联素对LPS诱导的血管外膜成纤维细胞迁移、增殖及肌化的影响；2探讨脂联素对LPS诱导的血管外膜成纤维细胞iNOS、ONOO-及NO的影响；3探讨脂联素发挥上述作用的可能信号转导通路。研究结果将为更深入地研究脂联素对血管的作用途径和作用机制奠定理论基础。
　　 方法：
　　 1体内实验：
　　 1.1动物实验：
　　 90只10-12周龄的雄性apoE-/-小鼠实验全程高脂饮食喂养。
　　 1.2血清脂联素浓度分析：利用大鼠抗人脂联素ELISA试剂盒分析高脂饲料apoE-/-小鼠转染腺病毒前后血清脂联素浓度。
　　 1.3 AS斑块的超声影像学形态特征：应用显微超声技术测量斑块面积。
　　 1.4生化指标检测：取实验前后全部动物眼球后采血，测定血脂浓度。
　　 1.5一氧化氮生成检测：取实验前后全部动物眼球后采血，测定血清中一氧化氮浓度。
　　 1.6病理学检测：颈动脉斑块组织学切片分别行苏木素一伊红染色，免疫组织化学染色观察iNOS和ONOO-的局部表达。
　　 2体外实验：
　　 2.1细胞培养：同论文I。
　　 2.2实验分组
　　 2.2.1根据APN的刺激浓度分组
　　 2.2.2根据有无siRNA-AdipoR1转染及AMPK抑制剂分组
　　 2.3 siRNA干扰AF AdipoR1蛋白表达的检测：western blot检测转染细胞β-actin， AdipoR1的蛋白质表达水平。
　　 2.4 MTT试验：观察APN和LPS刺激后，AF在不同时间点的增殖能力。
　　 2.5划痕法和transwell法：观察APN和LPS刺激后，AF在不同时间点的迁移能力。
　　 2.6一氧化氮生成检测：观察APN和LPS刺激后，AF生成一氧化氮的变化。
　　 2.7 RT-PCR:观察APN和LPS刺激后，iNOS和β-actin的表达，采用“2-ΔΔCT方法”分析基因的表达量。
　　 2.8蛋白印迹分析：观察APN和LPS刺激后，iNOS、nitrotyrosine、p-AMPK、p-ACC和β-actin的表达。强弱用表达的蛋白和β-actin条带积分光密度的比值表示。
　　 2.9免疫细胞荧光染色：观察APN和LPS刺激后，FITC和TRITC二抗标记的α-SM-actin在AF中的表达，用IOD比较它们在不同分组间表达的强弱。
　　 结果：
　　 1体内试验
　　 1.1动物的基本特征
　　 1.2血清脂联素浓度
　　 1.3 AS斑块影像学特征
　　 1.4脂联素对血脂的影响
　　 1.5脂联素对血清N0的影响与转染前和外膜局部转染Ad-GFP比较，NO浓度明显降低。
　　 1.6脂联素对血管壁iNOS和ONOO-的影响与转染前和外膜局部转染Ad-GFP比较，iNOS和ONOO-的表达明显降低。
　　 2体外实验
　　 2.1 AF的孵育和鉴定：同论文I。
　　 2.2 siRNA干扰AF AdipoR1蛋白表达的效果应用不同浓度siRNA-AdipoR1转染AF进行RNAi，western blot检测AdipoR1的表达随转染浓度的增加逐渐减低，而β-actin的表达不受影响。
　　 2.3 APN和LPS对AF增殖的影响
　　 (1)LPS对AF增殖的影响：通过MTT试验证实，与正常细胞对照组相比，LPS促进AF的增殖。
　　 (2)APN对AF增殖的影响：通过MTT试验进行OD值的比较，APN不影响正常AF细胞的增殖能力。与LPS组相比，APN+LPS组0D值下降。与APN+LPS组相比，siRNA-adipoR1+APN+LPS组和Compound C+APN+LPS组0D值升高。
　　 2.4 APN和LPS对AF迁移的影响
　　 (1)LPS对AF迁移的影响：划痕实验显示随着LPS刺激时间的延长，LPS导致的AF的迁移能力逐渐增加。
　　 (2)APN对AF迁移的影响：与LPS组相比，APN+LPS组AF迁移距离和迁移细胞数减少。
　　 2.5 APN和LPS对AF向MF转化的影响
　　 (1)LPS对AF向MF转化的影响：与正常细胞相比，LPS导致AFα-SM-actin单抗染色阳性的细胞数逐步增加。
　　 (2)APN对AF向MF转化的影响：与LPS组相比，APN+LPS组AFα-SM-actin单抗染色阳性的细胞数减少。
　　 2.6 APN和LPS对AF一氧化氮生成的影响
　　 (1)LPS对AF一氧化氮的影响：正常情况下，AF产生少量的一氧化氮；加入LPS刺激后，AF一氧化氮的产生增加。
　　 (2)APN对AF一氧化氮的影响：与LPS组相比，APN+LPS组AF产生的N0减少。
　　 2.7 APN和LPS对AF iNOS和ONOO-表达的影响：
　　 与LPS组相比，APN+LPS组AFiNOS和ONOO-的表达降低(P均＜0.01)。与APN+LPS组相比，siRNA-adipoR1+APN+LPS组.和Compound C+APN+LPS组AFiNOS和ONOO-的表达升高(P均＜0.01)。
　　 2.8 AF一氧化氮产生的信号转导通路通路的影响：
　　 与LPS组相比，APN+LPS组和APN组AF的p-AMPK和p-ACC的表达增加(P均＜0.01)。与APN+LPS组相比，siRNA-adipoR1+APN+LPS组和Compound C+APN+LPS组AF的p-AMPK和p-ACC的表达降低(P均＜0.01)。
　　 结论：
　　 1血管外膜局部转染Ad-APN后血清血脂水平下降，体重减轻，说明脂联素可通过外膜局部干预发挥改善代谢的作用。
　　 2血管外膜局部转染Ad-APN后，血清过度增高的NO浓度明显下降，血管壁iNOS和ONOO-表达降低。提示脂联素可能通过抑制iNOS和ONOO-的表达来发挥外膜抗动脉粥样硬化作用。
　　 3体外实验证实，LPS对AF的迁移、增殖和肌化均有促进作用，而APN能够有效地抑制LPS对AF的迁移、增殖和肌化的促进作用。
　　 4体外实验证实LPS能够激活AF的iNOS，使NO和ONOO-产生增加，而APN能够抑制LPS对iNOS的影响。
　　 5体外实验证实，APN通过AdipoR1，激活AMPK通路，抑制iNOS的激活及NO和ONOO-的产生，抑制LPS造成的AF功能变化。

目录

声明

论文Ⅰ脂联素受体在血管外膜及血管外膜成纤维细胞中表达的研究

符号说明

前 言

1.材料和方法

2.结 果

3.讨 论

4.结 论

5.附 表

6.附 图

7.参考文献

论文Ⅱ脂联素抑制多糖介导的血管外膜成纤维细胞增殖、迁移和肌化的研究

符号说明

前 言

1.材料和方法

2.结 果

3.讨 论

4.结 论

附 表

附 图

参考文献

攻读博士学位期间发表的论文

致谢

外文论文一

外文论文二

外文论文三