三种蠕形螨酸性磷酸酶、碱性磷酸酶染色方法的研究和正交试验法建立山羊蠕形螨ISSR-PCR的最佳反应体系

摘要

目的：探索毛囊蠕形螨、皮脂蠕形螨和山羊蠕形螨体内两种酶的染色方法:酸性磷酸酶染色采用Gomori铅-二甲基亚砜法(dimethyl sulfoxide,DMSO);碱性磷酸酶染色采用偶氮偶联法(Kaplow法),确定这两种酶在螨体内的存在及分布情况。为进一步研究这两种酶在螨体内的生理功能和致病性打下基础。
　　 改良山羊蠕形螨基因组DNA的提取方法,用正交试验法筛选出山羊蠕形螨ISSR-PCR(Inter-simple sequence repeat polymerase chain reaction)的最佳反应体系,并用梯度PCR方法筛选出此PCR的最佳退火温度,为利用ISSR分子标记研究蠕形螨的遗传多样性奠定基础。
　　 方法用自制刮片式取螨器加压刮取人额部皮脂,用镊式取螨器加压刮取人鼻翼处皮脂[1];切开新鲜山羊皮下结节取出其中干酪样物物[2];将样本与洗洁精混合均匀,在解剖镜直视下,用自制挑螨针将螨从皮脂中分离并反复清洗干净并分类。将洁净螨体置于双蒸水中,于-20℃冰箱中冷冻24小时后,采用蠕形螨整体染色法染色:用Gomori铅-DMSO法对三种蠕形螨酸性磷酸酶进行染色,用偶氮偶联法对三种蠕形螨的碱性磷酸酶进行染色,并分别设立去底物阴性对照组。
　　 用自然沉降法收集山羊蠕形螨,用基因组DNA提取试剂盒提取山羊蠕形螨DNA并以此为模板,以加拿大British Columbia大学设计的ISSR引物序列UBC848:(CA)8RG(R为一分子的嘧啶)为引物,利用正交试验法,建立一个L16(45)(L表示正交表;16表示有16行,即安排16次试验;5表示5列,即有五个因素;4表示每列有四个水平)的正交表,从Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物用量、DNA模板用量和TaqDNA聚合酶5个因素、各4个水平对山羊蠕形螨ISSR-PCR反应体系进行优化,用极差分析和方差分析分析结果,并根据筛选出的最佳水平组合,用梯度PCR的方法筛选PCR反应过程的最佳退火温度。
　　 结果经过染色,三种蠕形螨体内酸性磷酸酶所在部位被染成棕黄色,碱性磷酸酶所在部位被染成紫蓝色或紫黑色,阴性对照组均不显色。
　　 找出了一种快速清洗山羊蠕形螨及提取山羊蠕形螨基因组DNA的方法,大大缩短了DNA提取时间。通过正交试验法,筛选出山羊蠕形螨ISSR-PCR的最佳反应体系,即25μl反应体系中包括:1×PCR缓冲液,2.0mmol/L Mg2+,0.4mmol/LdNTPs,30pmol引物,30～60ng模板DNA,2.0U Taq酶。通过梯度PCR试验筛选出引物UBC848的最佳退火温度为49℃。
　　 结论本实验用Gomori铅-DMSO法对三种蠕形螨酸性磷酸酶染色,用偶氮偶联法对三种蠕形螨碱性磷酸酶染色,结果显示实验组三种蠕形螨体内都有不同程度的着色,再次证明了三种蠕形螨体内都有酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的存在,为进一步研究这两种酶在螨体内的生理功能和致病性打下基础。结果还显示不同时期、不同种类的螨体着色强弱有差异,说明不同时期、不同种类的蠕形螨体内酶的活性不同。
　　 正交试验法既可分析不同因素之间的交互作用,又可得出正交表中最佳处理组合,还可以分析每一因素不同水平对扩增结果产生的影响,从中得出最优水平的组合,弥补了单因素试验法和完全组合设计的不足,本试验选用L16(45)正交表,1次进行了16组PCR扩增,分析了Mg2+、dNTPs、引物、DNA模板和Taq DNA聚合酶对ISSR-PCR扩增的影响,得出了稳定且重复性好的ISSR反应体系;并通过梯度PCR法筛选出了引物UBC848的最佳退火温度为49℃,这一扩增体系和退火温度的建立为今后利用ISSR标记研究蠕形螨的遗传多样性做了前期准备。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:符号说明

前言

第一章 三种蠕形螨酸性磷酸酶、碱性磷酸酶染色方法的研究

材料与方法

结果

讨论

第二章 正交试验法建立山羊蠕形螨ISSR-PCR的最佳反应体系

材料与方法

结果

讨论

小结

附图

参考文献

致谢

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